Visium HD是一种可用于检测人和小鼠新鲜样本以及FFPE石蜡切片样本高分辨率的空间转录组表达的技术。而单细胞测序技术允许在单个细胞水平直接分析基因表达，并在单细胞水平分析细胞内群体异质性、定义细胞类型、细胞状态和细胞的动态转变。它能够提供细胞间的遗传异质性和功能差异信息，这对于理解复杂生物学过程中的多种类型细胞以及不同细胞命运、状态和功能至关重要。
由于先前的Visium v1和v2都是低分辨率的空间转录组学技术，其捕获和分析的基本单位是直径为55μm，间距为45μm的Spot，一个Spot通常含有多个细胞，后续分析重点通常放在感兴趣区域和先验选择的基因上，目的是识别区域的细胞组成、基因空间表达模式，进而分析特定位置的细胞状态、推断细胞间的通讯以及确定生物体中重要的表型和功能，而如果想要精确到细胞亚群的研究则必须要结合单细胞转录组测序的结果。那高分辨率的Visium HD就能解决这个问题吗？做了Visium HD，还要做单细胞测序吗？
正如目前做了干实验，还是建议结合湿实验得出更稳健的结论一样，可以说，做了Visium HD，还是要结合单细胞转录组的数据展开深入挖掘的。
01 从高分辨率空转与低分辨率空转数据的比较上来看 从单细胞和空转数据的分析思路上来讲，相比于低分辨率空转数据，只使用高分辨率空转数据本身进行细胞大类的无监督聚类和高比例细胞群体的再分群是比较轻松的，因为低分辨率空转的最小研究单位（Spot）有很大概率是一个混合体。
Visium HD相比于低分辨率空转数据，基本研究单位（bin）是混合体的概率更小，这使得无监督聚类和再分群的结果更加精细。然而，高分辨率数据也带来了新的挑战，如一个bin可能覆盖多个细胞或细胞的部分结构，也可能覆盖细胞外基质区域。因此，如果你想要看得更细，使用已有的绝大多数是基于单细胞数据建立起来的亚群体系和亚群marker去做标注就困难得多了，如可能会发现明显的细胞标志基因在某一cluster中表达占比极小。可以依靠高清HE图像细胞分割后生成掩膜，然后将Visium HD数据的最小研究单位（2μm bin）中的转录本分配到所属的掩膜当中去，以解决这种覆盖问题。随之也带来了细胞分割的适配性和可能舍弃的细胞质部分等问题。此外，即使做到了很好的细胞分割，由于Visium HD的表达基因通量的限制，还是很难基于自身数据的无监督聚类进行亚类注释。
也就是说，相比于Visium v2，Visium HD只是提高了空间上的分辨率，可以让我们看到更细微的区域的转录本变化和细胞组成，受限于其基因通量（FFPE样本本身RNA含量较少、基于探针的检测原理等原因），分子水平上的分析和功能探索还是有限的。
Visium HD检测灵敏度与Visium v2相当
02 从研究目的来看 如果想要进行的研究涉及到RNA的序列分析，如使用重建库的基因组进行研究、想要挖掘BCR、TCR的序列信息等，那么Visium HD可能不是最合适的工具。Visium HD技术主要关注于人和小鼠基因表达的空间定位，其实验原理是基于探针特异性结合RNA后，对探针进行建库测序，主要目的是为了做基因的定量检测。
03 从Visium HD与10x Flex数据分析的比较上来看 10x发表的首篇Visium HD文献使用相邻切片做了scFFPE-seq，对该单细胞数据进行了细胞类型注释后使用该数据对Visium HD数据进行了去卷积注释。将Visium HD 无监督聚类结果与去卷积注释的结果进行比较，从每个样本的混淆矩阵热图中可以看出，几类明显的细胞类型可以通过无监督聚类检测到，但对于一些数量较少的细胞类型，特别是免疫细胞亚型很难与无监督聚类的结果达成一致。因此，根据 Visium HD 数据的无监督聚类来识别组织中的细胞大类，基本上是没有问题的，但是要是想要研究亚类，使用常规的差异基因和marker基因注释容易引入比较大误差。此时还是建议基于单细胞数据进行反卷积注释，因为由反卷积算法引入的系统性误差将均匀地影响所有样本，不会引入样本间比较的偏差。此外，使用统一的单细胞注释作为参考，可以确保不同样本在细胞类型注释过程中遵循相同的标准和流程，可以减少因方法学差异导致的变异，从而使得样本间的比较更加公平和准确。
04 高清空转研究思路举例 • 思路一：针对空间上发现的异质存在的肿瘤区域展开研究（如有完整包膜的良性肿瘤区和边缘弥散的恶性侵袭区），探索这些区域的细胞组成、marker和功能。注：也可以锁定在Visium HD的无监督聚类和单细胞的无监督聚类中共同发现的异质的肿瘤细胞。
• 思路二：探索关注的基因（如一些临床检验标志物）在空间上的表达，发现罕见的阳性/阴性群体，探索这种新型细胞/区域的marker和功能，可进一步结合临床信息（如预后、疗效等）展开研究。
• 思路三：在空转数据分析中发现一些感兴趣的特殊的细胞类型（如通过空转数据的分析，发现一些边界细胞/过渡细胞），通过表达谱的相似性，从单细胞数据中提取出该种细胞类型，利用高通量的基因表达数据展开分子功能上的研究。
• 思路四：对Visium HD数据进行反卷积注释后，提取肿瘤边界的非混合细胞进行无监督聚类，探索肿瘤微环境。
• 思路五：对Visium HD数据进行反卷积注释后，对指定细胞的空间分布进行核密度分析来探索空间分布特点。
综上所述，虽然高分辨率空转数据带来了新的机遇与挑战，通过结合多种分析工具和方法，缩小和锁定关注的空间区域，可以开展更为精细的研究。尽管Visium HD提供了高分辨率的空间转录组数据，能够揭示组织内部的细胞类型和状态，但它并不取代单细胞测序。Visium HD提供的是空间层面上的基因表达信息，而单细胞测序提供的是单个细胞层面上的详细基因表达和遗传信息。两者可以互为补充，Visium HD数据结合单细胞转录组数据展开分子和功能上的研究，可以得出更加稳健的结论，所以，做Visium HD的同时，还是建议做单细胞测序的，如果可以的话，使用相邻切片进行scFFPE-seq，两组学数据得出的结论更为一致。
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