10x Visium / CytAssist，即10x空间转录组，是能够在组织切片中无偏差地检测基因表达谱，并将其与组织的空间结构相对应。这项技术允许研究者同时获得组织中上万个基因的表达信息，并揭示这些基因在组织中的活性位置。但是由于空转芯片上的spot (一个分析单元)的大小为55μm，远远大于一个细胞的大小。这种情况下，会导致一个spot中测到的转录本为多个细胞的转录本表达，因此需要有一定的方法来区分和确定spot中的主要细胞类型信息。
10x单细胞转录组可以对单个细胞的转录本进行测序，并通过算法将不同类型的细胞进行区分，进而可以在单个细胞的分辨率下对细胞的基因表达开展分析。但是在对组织解离或抽核的过程中，因为需要制备单细胞悬液，导致细胞的空间位置信息丢失，无法获取细胞的空间分布。由于单细胞的特性，使其可以作为鉴定空转spot中主要细胞类型的参考依据。
因此，通过将空间转录组和单细胞转录组相结合，一方面可以将二者进行优势互补，利用单细胞转录组的单个细胞测序精度，和空间转录组保留了细胞的空间位置信息，有助于我们更加准确的同时研究细胞的基因表达和空间分布情况。另一方面，两者的结果可以相互印证，有助于后续的实验设计和开展。今天就让我们来了解一下为什么做Visium/CytAssist，还要做单细胞测序的原因吧。
（1） 通过单细胞转录组完成对细胞类型，包括大类和亚类的注释，得到细胞类型的参考依据；
（2） 通过空间转录组获得spot的表达谱
（3） 通过算法将单细胞转录组与空间转录组结合，用单细胞的表达谱作为参考对空转切片进行映射和反卷积，对空转切片的spot进行细胞类型的定义。
（4） 定义后的spot可以进一步进行空间邻域的分析，例如邻域的细胞分群、转移，邻域的细胞互作等。
（5） 单细胞转录组和空间转录组也可以单独进行分析，单细胞转录组可以进一步通过细胞类型进行机制的探究，空间转录组可以进行通过HE染色识别空间的区域进行差异分析和细胞类型的分布统计。
图 1 单细胞和空转联合分析思路
刚才我们提到了两种单细胞和空转联合的算法：映射和反卷积。映射是通过算法将单细胞的表达谱作为参考，对每个spot进行相关性的计算，得到spot中每种细胞类型的相关性分数，取相关性分数最高者作为这个spot最有可能的细胞类型。反卷积也是将单细胞表达谱作为参考，与映射不太一样的是：反卷积可以计算出spot中的细胞类型占比，近年来随着不同反卷积算法的开发，又逐渐可以通过算法去进行图像识别并将单个细胞的大致空间分布进行确定等，丰富了单细胞和空转之间的联合方案。
举一个简单的例子，我们的组织就像一个大披萨，单细胞转录组将披萨上的用料单独挑出并分类，但是失去了这些用料在披萨上的空间分布信息。空间转录组虽然可以对披萨的每一片进行观察，但是每一片上的用料是混合的状态，影响了对每一片的分析。映射是通过直接去计算用料和切片的相关性，对披萨上的切片进行直接定义，比如第一块是菠萝，第二块是火腿；而反卷积可以得到每一片上的信息，例如第一片上有30%的菠萝，20%的火腿，或者是标记火腿、菠萝这些用料的大致位置。
图 2 空间转录组与单细胞转录组的关系
左边是空间转录组，可以提供空间位置信息，右边是单细胞转录组，可以分析单个细胞类型的特征
案例一：Spatial multiomics map of trophoblast development in early pregnancy
期刊：Nature
IF: 69.504
发表时间：2022 May
研究聚焦于人类胎盘的细胞外胚层细胞（EVTs）与子宫蜕膜之间的关系，这对于妊娠期间胎儿的滋养和保护至关重要。利用单细胞和单核RNA测序（scRNA-seq和snRNA-seq）以及空间转录组技术（Visium）生成了人类母胎界面的多组学单细胞图谱。
文章通过细胞图谱揭示了EVTs分化的全轨迹，并预测了调节EVT侵袭的转录因子。并定义了EVT侵袭的最终细胞状态的转录组：胎盘床巨大细胞（GCs）和内皮EVTs（eEVTs）。预测了促进EVT侵袭和胎盘床巨大细胞形成的细胞间通信事件。最后模拟了间质EVTs和内皮EVTs在早期妊娠期间动脉转化的双重作用。
本文开发了一种名为StOrder方法，结合单细胞转录组数据和空间转录组数据，重建了EVTs的侵袭轨迹，提供了人类EVTs细胞状态的全轨迹描述，以及它们在第一孕期的空间生态位。利用cell2location工具将单细胞数据中的细胞类型映射到空间转录组数据中，以确定细胞类型在组织中的空间位置。通过这种方式，研究人员能够在空间上解析EVTs与蜕膜细胞之间的相互作用，并系统地解析早期妊娠期间的相互作用。
案例二：Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer
期刊：Nature Genetics
IF: 41.376
发表时间：2022 Aug
研究通过对胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）进行深入的分子和细胞层面的研究，以揭示该疾病的异质性和潜在的治疗靶点。利用单细胞/单核RNA测序（scRNA-seq/snRNA-seq）、批量蛋白质组学、空间转录组学和细胞成像技术，对83个来自31位患者的空间样本进行了分析，研究了PDAC的细胞类型异质性、肿瘤微环境在治疗前后的变化，并对PDAC的发展提出了新的模型解释。
文章通过scRNA-seq，在73个样本中识别出176个肿瘤细胞亚群，这些亚群在不同病例中表现出特定的信号通路富集，如细胞增殖、细胞应激反应、EMT和免疫相关信号通路。结合空间转录组发现，某些肿瘤亚群在空间上表现出异质性，即它们主要来自每个病例中特定的空间样本。这种多维方法揭示出有着不同组织学特征的细胞亚群，它们代表了癌症进展的过渡阶段。文章同时描述了腺泡-导管化生细胞和胰腺上皮内瘤变细胞的存在，前者仅在动物模型中观察到，之前未在人类样本中鉴定出，而后者被证实构成了前期病变。同时研究结合单细胞转录组和空间转录组发现，TIGIT在调节性T细胞（Tregs）和耗竭的CD4+ T细胞中高表达，而NECTIN家族分子在肿瘤细胞中高表达，提示TIGIT-NECTIN轴可能是PDAC免疫治疗的潜在靶点。
总而言之，Visium/CytAssist技术和单细胞测序技术是两种互补的空间生物学分析工具，它们各自具有独特的优势和应用场景。空间转录组技术允许在组织切片上同时进行转录组和蛋白质的检测，并且与组织形态表型进行关联分析，这对于理解细胞在组织中的特定位置和功能至关重要。
然而，尽管空间转录组提供了空间分辨率的基因表达数据，但它通常在一个spot中包含多个细胞，因此无法达到单细胞水平的分辨率。这就是为什么在进行空间转录组分析之后，还需要进行单细胞测序。单细胞测序技术能够提供单个细胞的基因表达数据，从而揭示细胞间的异质性，这对于理解细胞功能、细胞状态和细胞间相互作用至关重要。
将空间转录组和单细胞转录组测序联合使用，可以获得更全面的生物学见解。空间转录组提供了细胞在组织中的空间分布信息，而单细胞测序则提供了细胞的详细分子特征。这种联合分析可以帮助识别和表征稀有细胞类型，理解细胞状态的变化，以及揭示细胞间通讯和相互作用的复杂网络。因此，两者的结合使用能够提供从空间分布到单个细胞的多尺度生物学信息，极大地增强了对复杂生物系统的理解。
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