1.单细胞实验样本制备的质量优化：如死细胞、细胞碎片等干扰背景的去除；
2.特定细胞分选：如分选免疫细胞/非免疫细胞（CD45+）；
3.单细胞测序后期验证：如免疫细胞的分类鉴定等。
本篇文章主要针对流式分选在单细胞应用中的第二个应用：特定细胞分选做出阐释，流式细胞阴选和阳选分选是流式细胞术的重要应用之一，但是流式分选过程中目标细胞特性、样本质量（细胞活率/目标细胞占比等）、抗体的选择以及仪器的调试等均会影响分选的纯度及分选得率。那么有效目标细胞少？还能做单细胞测序吗？当目标细胞数量少时，又有什么解决方案呢？
1.预计捕获细胞数：8000-10000
2.捕获效率：50%~65%
3.所需上机细胞数：50000
4.回收率：按照50%计算（分选条件、纯度模式以及细胞黏附、细胞死亡等方面的影响会降低回收率，50%仅为一般的参考值）
5.纯度：90%以上（与起始细胞浓度、目标细胞占比、分选速度、分选模式相关，通常单次分选可达到90%以上）
（后续实例均以此数值为基础）
1.与原始细胞混合方案：适用于目标细胞占比较低，分选出目标细胞量不足50000，或关注整体细胞图谱的客户
【样本类型】造模小鼠肠道组织；
【客户目的】关注免疫细胞，但目标细胞占比仅5%不到，同时想知道此类模型下小鼠
结肠组织全细胞图谱
【解决方案】参考文献，按照与原始细胞按照比例混合后上机
方案参考高分文献如下所示：
【文献案例】
英文标题：Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma1
发表期刊：Cell（IF：45.5）
发表时间：2020
样本类型：肝细胞癌组织
混合方案：CD45+：CD45-=3：1，为了获得足够分析的免疫细胞
研究思路：
研究内容：
肝细胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)复发率高，5年生存率低。复发性HCC的单细胞分析可能有助于设计有效的抗癌疗法，包括免疫疗法。作者对18例原发性或早期复发性HCC病例组织进行了特异混合的单细胞转录组研究。通过对单细胞转录组进行细胞分群分析，作者发现与原发性肿瘤相比，早期复发性肿瘤的调节性T细胞水平降低，树突状细胞增加，并且浸润的CD8+T细胞增加。对这些细胞的转录信息进一步分析，作者发现复发性肿瘤中的CD8+ T细胞过表达KLRB1 (CD161) 并表现出先天性低细胞毒性状态，这与原发性HCC中观察到的经典耗竭状态不同。作者进一步通过差异基因表达和相互作用分析揭示了复发性肿瘤细胞中潜在的免疫逃避机制，这些机制可抑制树突细胞抗原呈递并招募先天性CD8+ T细胞。
【样本类型】小鼠肿瘤组织，可收取的肿瘤组织量多；
【客户目的】关注某一类T细胞亚类（需进行多轮分选），但目标细胞占比仅1%不到，
同时想知道此类肿瘤样本全细胞图谱信息
【解决方案】通过多轮靶标分选出目标细胞，并使其达到上机量（50000）并进行单细胞转录组测序，新鲜解离出的原始细胞上机进行单细胞转录组测序
【文献案例】
英文标题：The landscape of tumor cell states and ecosystems in diffuse large B cell lymphoma2
发表期刊：Cancer Cell（IF：48.8）
发表时间：2021.10
样本类型：弥漫性B细胞淋巴瘤组织
研究方案：分选B细胞（CD19+和CD20+），与淋巴瘤组织单细胞数据
研究思路：
研究内容：
弥漫性B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）的生物学异质性部分由细胞亚型和相关的基因组病变驱动，但也受到肿瘤微环境（TME）中不同细胞类型和细胞状态的影响。然而，在大规模上解析这些细胞状态及其临床相关性仍然具有挑战性。EcoTyper是一个集成了转录组和单细胞RNA转录组数据的机器学习框架，并可以被用于表征临床上相关的DLBCL细胞状态和生态系统。作者在文章中实施了EcoTyper这种方法，通过这种方法，作者鉴定了五种恶性B细胞的细胞状态，这些状态在预后关联和分化状态上有所不同。同时，作者还鉴定了构成免疫微环境中构成相互作用的其他12种谱系的细胞状态存在显著差异。虽然细胞来源亚型具有不同的免疫微环境组成，但是本篇文章的结果揭示了现有淋巴瘤临床异质性，在系统分辨率上解决了DLBCL微环境并为靶向治疗确定了机会。
如果目标细胞占总数的1%及以下，还可以做流式阴选吗？
【样本类型】胸腺组织
【客户目的】客户关注基质细胞，占比约为1%以下
【项目流程】预计通过CD45-阴选获取，但基质细胞的比例不稳定，这与以下原因有关：
非目标细胞干扰严重：非目标细胞数量庞大，背景信号、不同类型的非目标细胞使得准确去除非目标细胞变得困难；
分选准确性降低：背景复杂，非目标细胞占比高情况下，容易难以区分荧光信号；
富集效率难以保证：按照分选正确率为99%情况下，当阴选占比1%的细胞时，最终纯度也仅为50%。
【项目结果】阴选分选出的基质细胞纯度非常不稳定，进行单细胞测序后的细胞注释结果不稳定
如果目标细胞占总数比率低，且耐受性非常差，还可以做流式分选富集吗？
【样本类型】肠道炎性组织
【客户目的】客户关注嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞，目标细胞在组织中占比约1%
【项目流程】分选出的细胞活性很低，不满足上机需求，这与以下原因有关：
目标细胞非常容易受刺激死亡，嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞在体外环境中很快失去活性；
目标细胞占比低，为了获取一定数量的目标细胞，分选时间增长，增加细胞在体外环境暴露时间，导致细胞活性降低。
【项目结果】分选细胞活性低，不满足上机要求
1. Sun, Y. et al. Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma. Cell 184, 404-421.e16 (2021).
2. Steen, C. B. et al. The landscape of tumor cell states and ecosystems in diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell 39, 1422-1437.e10 (2021).
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