RNA表观：m6A课题设计思路-国自2025专题

2024年，单细胞空间组学技术继续在各大学术杂志上霸屏刷榜，然而另一个当红炸子鸡m6A研究慢慢进入到了精细化耕作阶段。与多年前的惊艳相比，2024年m6A研究慢慢陷入了一个低谷，但是通过这一轮筛选，一定会出现更多优秀的m6A研究。从各大顶级期刊已发表的m6A论文来看，占坑类文章的潮水开始褪去，向着更加明确的应用场景延伸，涉及到的课题方向已经脱离了传统甲基化酶→靶基因→与表型关联的三板斧套路。m6A诸多研究如今仍然如火如荼展开，接下来我们将从几个维度帮各位老师梳理一下。究竟要不要做预实验？前期在测序前要做哪些工作？自己做的课题是否会过时？有哪些前沿方向值得深入研究？......看完这篇推文你会思路更加清晰。

我们以2024年6月公布的SCI影响因子来作为标准，在Pubmed上以“m6A”和“RNA methylation”作为关键词后我们发现，截止到本文发稿，今年1-11月份仍然有超过2300篇m6A相关研究发表，其中>10分的研究仍然有近500篇，占比超过21%。

当然这其中的规律出现了一些小小的变化。早些年肿瘤领域的基础研究文章较多，从去年开始到今年，发表的文章标题中直接显示m6A甲基化越来越少，开始重新聚焦到生物学故事本身。其他研究包括植物学等前些年小众领域目前也有越来越多的闯入者。其中单细胞测序+m6A测序、m6A+翻译组测序等新型多组学联合，开始在免疫学、肿瘤微环境、发育生物学等领域发力。

所以从目前发文整体趋势来看，每年仍然在2000多篇左右，未达到“烂大街”程度。这边建议从2个角度来提升自己课题的创新性：① 与多组学联合；② 关注三类甲基化酶本身携带的蛋白修饰现象。

目前无论是哺乳动物还是植物，m6A的三类甲基化酶几乎没有出现太大变化，这边也帮老师进行了简单的总结，具体如上图所示。但是需要注意的是，哺乳动物目前在细胞系上出现了一类新的甲基化酶——外显子拼接复合体（exon junction complexes, EJCs）。EJCs作为m6A“抑制器”调控mRNA m6A的区域选择性，从而决定了整体m6A表观组分布特异性的多个关键特征。具体可查看何川教授2023年刚发布的Science（案例解析：沃尔夫奖得主何川教授Science发文揭开m6A领域的长期谜团 | m6A专题）

那么，m6A修饰在动植物中具体参与哪些生物学过程呢？这里归纳了3方面，分别是参与了RNA核内加工、RNA从核内转运到胞质以及引导mRNA的降解或影响翻译。此外，我们也总结了在研究m6A修饰必须要关注的3个方面，一个是m6A修饰对表型的影响，也就是结合生物学现象去讲故事，另一个是结合三大甲基化酶去阐述m6A修饰调控机制，还有就是重点关注m6A修饰发生差异的这些靶基因以及相互之间的调控关系。这也是要讲好m6A甲基化故事的三点要素。

m6A修饰参与的生物学过程（Cell Research (2018) 28:616–624）

上述步骤为经典的m6A研究三步走，但是现在其实大部分研究直接从第二步开始。

尤其是前期的预实验，并未必要检测整体m6A水平，如质谱法、ELISA酶标仪以及Dot Blot等。详情请点击：（都2021年了整体m6A水平没差异也能做m6A测序 | m6A专题）

那么假如非得做预实验的话，三类检测方法孰优孰劣呢？

① Dot Blot目前文章用的比较多，尤其是一些侧重点在生物化学和基础医学研究的论文，这类图一般都会放在论文的第一部分。虽说Dot Blot方法比较复杂，条件摸熟练后做出来结果会非常漂亮。在这边还是强烈推荐！Dot Blot参考文献：Nagarajan., et al. (2019). Dot Blot Analysis for Measuring Global N6-Methyladenosine Modification of RNA: Methods and Protocols.

Song H et al. Autophagy. 2019

② 酶标仪的最大优势是成本低速度快，3-4小时就能出来结果，三种方法里精确度较差但也是性价比较高的一种检测方法。需重复多次。不作为首要推荐检测方法酶标仪参考资料：EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit P-9005.

Chen M et al. Hepatology. 2018

③ LC-MS/MS是目前最靠谱的金标准，强烈推荐。参考文献：Bifeng Yuan (袁必锋)  (2017) Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for Analysis of RNA Adenosine Methylation. Methods in Molecular Biology.

进一步，具体来讲，m6A实验设计具体思路一般可分为两种路线。第一种就是通过转录组公共数据等结合验证，找到对应关注的酶，对酶敲除后看其表型变化以及酶的表达，有变化的话进行m6A测序和转录组测序，确定对应靶基因后，进行一些细胞动物水平更进一步的验证。第二种是先不做敲除和表型，可以初步看下哪些酶表达有差异，m6A整体水平差异，找到关注的酶，或直接不同分组做m6a和RNA-seq，找m6a修饰相关基因，对其甲基化敲除后，做pulldown和RNA-seq，联合确认靶基因，确认靶基因后和前面一样，做后续的验证实验。

前期预实验做完，后面就可以考虑进行m6A测序工作了。目前主流的m6A测序技术主要有三种，一个是基于polyA捕获法的常规m6A测序技术，也是目前最常用的，但对于样本要求也比较严格，需要RNA量＞20μg，RNA也不能有降解。而对于细胞、动物和临床样本，这里更推荐大家用第二种方法，也就是基于rRNA去除法的m6A测序技术，该方法对样本要求就不那么严格了，样本需求量更低，RNA起始量仅为常规m6A测序（polyA捕获法）的近一半，即20μg，最低只需10μg；允许RNA轻微降解，RIN值＞5，质检峰图中主峰较明显，依旧可以进行建库。并且获得的数据信息更加丰富，包含mRNA、lncRNA的m6A修饰信息。而如果样本量太少，达不到10μg，那可以选择第三种技术，微量m6A测序技术，这个技术也是去rRNA的方法，但它是先使用能够超低起始量扩增的方法也就是smart模板转换机制把总RNA全部使用扩增成cDNA，然后去除rRNA来源的cDNA，那么剩下的cDNA就可以用于建库测序了，这种方法可以使即使1μg的RNA也可以进行m6A的IP和建库测序。大家根据样本情况选择其一即可，这三种技术最后得到的数据都是非常稳定并且质量很好的，不过三种技术得到的数据因为建库原理不同，就不建议合并分析了。

这里展示的就是m6A和单细胞的联合分析思路，主要分为两部分。

第一部分，先锁定细胞类群和m6A调控因子，然后可以从两个角度去研究：（1）生物学角度，首先进行公共数据库转录组数据挖掘/常规分子生物学实验，锁定一些m6A甲基化相关基因，然后做m6A测序来确定m6A靶标基因，确定上游调控机制，同时做单细胞测序来探索m6A调控基因在肿瘤样本与正常样本之间，单细胞层面的结果差异。最后整合m6A结果和单细胞结果来探究m6A调控基因对肿瘤/癌症的影响。（2）m6A调控基因打分的角度，基于m6A调控分子的表达模式，对其无监督聚类，并根据聚类结果，可与患者预后，疾病等级等进行关联。基于m6A调控分子的表达模式，进行聚类，达到区分肿瘤样本与正常样本的目的。此外，我们还可以建立一套m6A打分机制，然后将这个机制与患者预后，肿瘤危险等级，肿瘤微环境特征等进行关联。

另一部分比较简单直接，主要进行核心基因的筛选，通过对m6A测序得到的差异靶标基因数据和单细胞的差异marker基因数据取交集，从而筛选出在肿瘤微环境中的核心调控基因，这里面涉及到的分析包括韦恩图可视化分析、四象限图可视化分析以及GO、KEGG富集分析。

这个就是我们整个联合分析的思路。

m6A+单细胞联合分析思路（联川首发方案）

在这些思路中，我们该如何使用m6A和单细胞数据呢？或者说m6A和单细胞数据在文章中的前后顺序是怎样设置呢？目前，结合网上搜集的以及我们用户已发表的m6A和单细胞联合应用文章。我们发现基本离不开下面这三种课题设计路线。（1）第一种路线，先锁定关注的甲基化酶，可以通过查找课题相关文章或者从别人已发表的公告数据库里筛选。然后把这个酶进行敲低、过表达等处理。然后做单细胞锁定酶基因表达富集的细胞亚群，然后把亚群分选出来在进行m6A测序，这个路线是比较新颖的。

（2）第二种路线比较经典，前三步就是我们大部分做m6A研究的客户经常使用的流程，甲基化酶锁定之后，敲低、过表达相关酶，再做m6A测序来锁定靶基因，但这时并不知道这个靶基因是在那个细胞亚群里的，然后就可以做单细胞测序来锁定细胞亚群中特定的m6A修饰靶基因。

（3）第三种路线比较适合已经做完单细胞测序的研究。首先做完单细胞测序拿到数据后，就可以在各个细胞亚群里看一下甲基化酶的表达情况，接下来分为两种情况，对应两种方法。第一种，细胞量足够的情况下，可以把特定细胞亚群分选下来做m6A测序，就像刚说的第一种路线一样。第二种，如果细胞量太少，分选下来的细胞亚群连微量m6A测序都不够做，那也可以把组织拿过来做m6A测序，因为我们甲基化酶已经锁定了，细胞亚群已经锁定了，那最后下游的就只剩下实验验证了，就比如做RNA-FISH原位杂交，来验证m6A调控因子的细胞定位就可以了。

m6A+单细胞联合分析路线

下面就趁热打铁分型一篇典型案例（类似于第三种路线）：

论文标题：YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells

发表期刊：Nature immunology

影响因子：27.7

发表时间：2023

样本选择：Ythdf2f/f和Ythdf2cKO小鼠的B16-OVA肿瘤和BMDMs

研究技术：单细胞转录组测序、m6A甲基化测序

这篇文章研究发现，m6A阅读蛋白YTHDF2可以通过影响IFN-γ–STAT1通路重编程肿瘤相关巨噬细胞，增强TAM抗原提呈能力，进而调控CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。下面就是这篇文章的研究思路。首先是通过公共数据库锁定甲基化酶YTHDF2，然后分析YTHDF2缺失对肿瘤进展的影响，接着在调控机制上，先通过单细胞测序数据挖掘出关键细胞亚群，巨噬细胞，并发现YTHDF2缺失能够激活巨噬细胞抗原呈递能力以及其中的一个重要的信号通路，来诱导抗肿瘤表型。最后，对敲低YTHDF2的巨噬细胞进行m6A测序，发现YTHDF2会降低巨噬细胞中STAT1基因的RNA甲基化修饰水平和稳定性。

研究思路解析

首先作者通过TCGA公共数据库分析，发现YTHDF2在乳腺癌、结肠腺癌等肿瘤组织中都呈现高表达。且YTHDF2 mRNA的表达与免疫评分呈负相关。同时通过公共数据库中的scRNA-seq数据分析结果表明，在多种肿瘤中，YTHDF2在肿瘤样本中的表达高于在邻近组织或正常组织。这些结果表明YTHDF2在肿瘤样本中表达上调。

图1 YTHDF2功能初步研究

接下来，作者通过对Ythdf2f/f和Ythdf2cKO小鼠的B16-OVA肿瘤单细胞测序，并通过细胞分群，细胞鉴定分析，细胞类群丰度差异分析发现，抗肿瘤marker基因表达增加，说明巨噬细胞中YTHDF2的缺失诱导了TAMs中的抗肿瘤程序。

图2 YTHDF2缺失可提升巨噬细胞的抗肿瘤极化

随后作者通过细胞通讯分析和体外抗原呈递实验发现，YTHDF2缺失的巨噬细胞具有更强的抗原交叉呈递和激活CD8+ T细胞的能力。

图3 YTHDF2调节巨噬细胞的抗原交叉呈递

为了进一步锁定靶标基因，作者对敲低了YTHDF2的巨噬细胞进行了m6A测序，通过GSEA分析，qpcr实验，磷酸化实验以及一些功能实验的验证，结果发现YTHDF2缺失调节巨噬细胞的IFNγ−STAT1信号通路来诱导抗肿瘤表型。

图4 YTHDF2缺失通过IFNγ-STAT1信号通路重新编程巨噬细胞

最后作者又对其中巨噬细胞进行了m6A-seq和rip-seq测序，发现YTHDF2缺失是通过m6A甲基化修饰方式来增加巨噬细胞中Stat1 mRNA稳定性来诱导抗肿瘤表型。

图5 YTHDF2降低了巨噬细胞中Stat1 mRNA的稳定性

总之，这篇文章通过联合m6A RNA甲基化测序（m6A-seq）和单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术，研究了YTHDF2在肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的功能及其对肿瘤免疫微环境的影响。研究首先利用scRNA-seq分析了YTHDF2基因敲除（Ythdf2cKO）和对照（Ythdf2f/f）小鼠肿瘤中的免疫细胞浸润情况，识别出不同细胞群的特征基因表达模式。接着，通过m6A-seq技术鉴定出YTHDF2结合的m6A修饰位点，特别是集中在Stat1基因的3'非翻译区（UTR），揭示了YTHDF2通过调节Stat1 mRNA的稳定性来影响巨噬细胞的抗肿瘤极化。结合这两种技术，文章阐明了YTHDF2在调控TAMs功能和增强CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫中的关键作用，为癌症免疫治疗提供了新的靶点。