图 scRNA-seq和snRNA-seq的比较
在Pubmed上检索“single nucleus seq”关键词，截至2024年12月能够找到1930篇见刊的单细胞核测序文章，其中2023、2024近两年占到了862篇，涉及到各类型组织。从下图可以看出，每年发表的关于snRNA-seq的文章数量逐年上升，也就是说，snRNA-seq技术在近两年已经被研究人员广泛应用。考虑到检索方式的不全面性，以及尚有部分研究成果未见刊，见微知著，snRNA-seq的应用潜力是非常巨大的！
图 Pubmed检索“single nucleus seq”结果图
（1） snRNA-seq的起源可以追溯到2013年美国克雷格·文特尔研究所在一篇PNAS文章上就提出了单细胞核转录组测序的方法1，该研究的对象是小鼠脑齿状回组织的神经前体细胞，核转录组测序有效地解决了神经组织样本很难制备完整的单细胞问题，以及避免了由于酶解引起的基因表达变化。另外通过与细胞转录组比较发现，核转录组的变异性低于细胞转录组！
（2） 2016年6月Science杂志发表了人冻存脑组织的单细胞核测序的研究2，临床上人脑组织很难通过获得新鲜样本即时开展单细胞研究，人死后冻存脑组织通过细胞核测序成为可能。细胞核测序在冻存脑组织中鉴定到了已知的和稀有的神经细胞亚型，表明核测序在细胞组分鉴定和基因检测上的价值。
（3） 2017年10月Nature Methods杂志发布了Broad研究所张锋&Aviv Regev团队开发的新技术—DroNc-seq单细胞表达谱分析技术3，该技术融合了sNuc-seq技术与微流控技术的单细胞核RNA测序方法，可以在结构复杂的组织或者冻存组织中更有效地分析大量细胞/细胞核中的RNA，开启单细胞核测序的规模化时代。作者利用DroNc-seq对小鼠/人脑组织进行了分析，并与Drop-seq、sNuc-seq以及其他较低通量的单细胞RNA-seq方法进行比较，结果显示DroNc-seq表现出了灵敏、高效且无偏向的细胞分类能力，该技术将为实现细胞图谱计划项目奠定了技术方案
（4） 2023年5月，发表在Genome Medicine上的文章4，检测了胰岛组织snRNA-seq和scRNA-seq结果，发现snRNA-seq与冷冻样品兼容，消除了解离诱导的转录应激反应。
（5） 在2023年，发表在Nature上的一篇关于禾本科植物的单细胞文章中5，对拟南芥和玉米的scRNA-seq和snRNA-seq的数据进行了比较，植物原生质体的制备方法由于不同植物和组织的差异性，制备很困难；并且和动物组织一样，容易引起酶反应应激。snRNA-seq则能够规避以上缺点，对于植物的特殊细胞类群提供更完整准确的结果。
snRNA-seq的优势
Ÿ Allows transcriptomic profiling of frozen tissue：适用于冻存样本
Ÿ Improves dissociation bias：改善细胞偏好性（scRNA-seq过解离/解离不充分造成的细胞偏好性）
Ÿ Eliminates artifactual gene expression：消除人为引入的基因表达（scRNA-seq酶解过程引入的应激基因表达）
Ÿ Provides similar gene detection compared with scRNA-seq：与scRNA-seq具有类似的基因检出率
Ÿ Accessible for large size cells：支持含大细胞（＞40μm）的组织
snRNA-seq的劣势
Ÿ Low sensitivity of detecting specific genes under certain conditions：特定条件下某些基因的检测敏感性降低
snRNA-seq的应用场景
但是snRNA-seq也存在检测基因少、免疫细胞占比低等问题。另外，抽核面临的主要难点是在保证核膜完整的前提下尽量去除细胞碎片和杂质，因此不同的组织提核的条件需要摸索。此外，不论snRNA-seq还是scRNA-seq，对细胞核/细胞的RNA完整性要求均很高，所以选择抽核的冷冻样本，冷冻前样本情况、冷冻后的保存情况对RNA质量均有较大影响，并不是所有冷冻样本都能构开展snRNA-seq。
snRNA-seq在不同类型的样本研究中被广泛应用：
对于常规样本：包括脑、不同脑区，神经节，心脏，肾脏，肌肉，肝脏，肺，胰腺，脂肪，胎盘迷宫，视网膜，血管，黏膜以及PBMC和细胞系等。
对于非模式物种样本：线虫、螨虫、贝类等。
对于植物样本：拟南芥、茶叶等。
以下整理了snRNA-seq应用于不同样本类型的文献一览表：（滑动查看，标黄部分为用户文章）
From 20,234 annotated protein-coding genes, 62% were found expressed (rpkm≥0.5) in the nucleus and 60% in the cytoplasm of HEK293 cells.
The 465 genes found only in the cytoplasmic fraction were in majority low expressed genes (average 1.2 rpkm), and could be detected in the nuclear fraction albeit below the detection threshold (average 0.3 rpkm).
Overall, a similar number of protein coding genes was detected by all methods.
其实不难想象，对于细胞核与细胞质的关系，就好比是“初级原料加工厂”和“产品包装厂”的关系，初级原料加工厂源源不断给产品包装厂运输大量的中间产品，这个过程是持续动态的，也就是说初级原料加工厂中肯定会保留各种产品的原始信息，snRNA-seq和scRNA-seq就好比是质检部门，分别检测“初级原料加工厂”的产品信息和“产品包装厂”的产品信息，这两个工厂的产品信息重叠度会非常高，只是说产品的数量（类比基因的丰度）可能会有差异。这样我们就很容易能够理解scRNA-seq和snRNA-seq在基因的检出率上不会相差太多这个观点了！
联川开展了非常多的snRNA-seq项目，以下展示了一批snRNA-seq vs scRNA-seq数据质量比较。该数据样本对象是小鼠大脑皮层，分别是3例抽核 vs 3例解离，基于10x Genomics平台进行细胞捕获，两种方式的测序数据比较如下：
（1） 数据质量指标
可以得出以下结论：
· 抽核和解离两种方式在捕获细胞/细胞核数量、平均细胞reads、基因中位数，以及检测的总基因数等方面相差不大。
· 从大量测试数据来看，snRNA-seq检测的细胞基因中位数或多或少会低于scRNA-seq的方式，当然这个情况也可能归因为低丰度基因过滤的问题。
· 不过scRNA-seq检测到的转录本有高于24%是来源于线粒体细胞器，或者由于酶解诱导的应激基因表达的转录本7。
· 从这个层面来说，snRNA-seq检测的基因信息并不逊色于scRNA-seq的方式。
（2） 捕获的细胞类型
可以得出以下结论：
· 解离的方式会造成免疫细胞的比率增大，显示出细胞偏好性。
· 相反，抽核能拿到更多的神经元细胞，能够反映组织最真实的细胞组分。
· snRNA-seq有自身的优势，也可以作为scRNA-seq的互补手段，以实现全面描述组织最真实的细胞组分和基因表达状态8。
细胞核悬液制备流程：采用裂解缓冲液，并添加蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂。
注：裂解液、裂解时间，实际会根据组织类型会选用合适的裂解液以及裂解时长
具体的步骤如下：
a) 用医用镊子将冻存组织转移至1.5 mL离心管，加入0.5 mL预冷的Lysis Buffer（10mM），立即将组织剪碎成米粒大小；
b) 将组织转移至组织研磨器，再加1.5 mL预冷的Lysis Buffer（10mM），上下缓慢研磨5-10次；
c) 冰上孵育5 min，期间可以吹打混匀数次，将匀浆液过70 µm细胞筛，收集至15 mL离心管；
d) 500 rcf，4°C，离心5min，小心弃去上清，可以残留少量体积（少于50 µl）；
e) 加入Wash Buffer，重悬混匀，500 rcf，4°C，离心5min，弃去上清；
f) 加入Wash Buffer重悬混匀(体积可以根据实际，调整至适合流式分选的浓度)；
g) 每1 mL样本加入10 µL 7AAD染液，冰上孵育5 min；
h) 使用 BD FACSAria II流式细胞仪，分选7AAD阳性的细胞核，将分选得到的细胞核收集于含有100 µl PBS + 1% BSA + 0.2U/µL RNase Inhibitor的5 mL流式管内；
i) 用AOPI染色，CountStar细胞计数仪计数，同时用台盼蓝染色，显微镜下镜检细胞核核膜完整性。
对于抽核的样本来说，常会碰到一些解离后破碎的大的细胞器（例如：线粒体）或者细胞碎片，无法通过离心的方法与细胞核进行区分，造成核悬液背景非常差！此外，对于抽核样本来说，由于细胞核具有大量的DNA和RNA，并且在特殊的离心和高钙环境的条件下，极容易造成细胞核之间的抱团和黏连体，并且通过离心等条件也是很难有较大改善的。联川引入3台BD Aria系列流式细胞仪，能解决核制备存在的问题，去除核悬液碎片，Ambient RNA，纯化细胞核悬液，为单细胞核测序保驾护航，推动单细胞研究进入核测序时代！
参考文献
1. Grindberg, R. V. et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences 110, 19802–19807 (2013).
2. Lake, B. B. et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science 352, 1586–1590 (2016).
3. Habib, N. et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods 14, 955–958 (2017).
4. Kang, R. B. et al. Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Medicine 15, 30 (2023).
5. Guillotin, B. et al. A pan-grass transcriptome reveals patterns of cellular divergence in crops. Nature 617, 785–791 (2023).
6. Sultan, M. et al. Influence of RNA extraction methods and library selection schemes on RNA-seq data. BMC Genomics 15, 675 (2014).
7. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L. & Humphreys, B. D. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology 30, 23 (2019).
8. Slyper, M. et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med 26, 792–802 (2020).
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