增强酶的结构稳定性并保持其催化活性是提高酶利用率和降低药物筛选成本的有效途径。然而，在现有的固定化技术中，由于构象变化和微环境的限制，固定化酶的活性往往会降低。本文提出了一种通过ZIF-8原位固定化和柠檬酸刻蚀策略制备高活性固定化乙酰胆碱酯酶的简便方法。CA破坏ZIF-8的配位键并产生缺陷，扩大孔隙，提高底物可及性，充分暴露酶的活性位点。与游离酶相比，乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA的催化活性增强了约6.10倍。此外，AChE@ZIF-8-CA表现出优异的包封率和对温度、pH和有机溶剂的良好耐受性。即使在五次重复实验中，相对活性仍保持在最初的83.77%。该策略为在温和条件下快速构建高活性固定化酶提供了一种新的有效途径。![]()
(A)乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA的制备示意图以及ZIF-8 (B，E)、乙酰胆碱酯酶@ZIF-8 (C，F)和乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA (D，G)的TEM和SEM图像。{100}、{211}和{110}晶面分别用红色、橙色和蓝色表示。
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游离乙酰胆碱酯酶和固定化乙酰胆碱酯酶的表征。(A)模拟的ZIF-8、ZIF-8、ZIF-8和ZIF-8-CA的XRD图案。(B)ZIF 8号、ZIF 8号和ZIF 8号的N2物理吸附等温线。(C)游离乙酰胆碱酯酶、ZIF-8、乙酰胆碱酯酶@ZIF-8和乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA的ATR-FTIR光谱。(D)游离乙酰胆碱酯酶、ZIF-8、ZIF-8乙酰胆碱酯酶和ZIF-8乙酰胆碱酯酶的荧光光谱。
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FITC-乙酰胆碱酯酶@ZIF-8 (A)、FITC-乙酰胆碱酯酶@ZIF-8在10% SDS洗涤后(B)、FITC-乙酰胆碱酯酶-ZIF-8 (C)和FITC-乙酰胆碱酯酶-ZIF-8在10% SDS洗涤后(D)的荧光图像。
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固定化乙酰胆碱酯酶的酶活性和动力学。钙浓度(A)和蚀刻时间(B)对固定化乙酰胆碱酯酶活性的影响。根据原始组的活性，相对活性被标准化为100%。(C)游离乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱酯酶@ZIF-8和乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA的相对活性。相对活性根据游离AChE的活性进行标准化。(D)游离乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱酯酶@ZIF-8和乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA对底物[ATChI]的反应速度V图。数据表示为平均值±标准差；n = 3个独立样本。
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固定化乙酰胆碱酯酶的稳定性。(A)固定化乙酰胆碱酯酶的热稳定性。(B)固定化乙酰胆碱酯酶的pH稳定性。(DMSO对固定化乙酰胆碱酯酶活性的影响。(D)固定化乙酰胆碱酯酶的循环性能。(黄色:乙酰胆碱酯酶@ZIF-8，蓝色:乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA)在最佳条件下，乙酰胆碱酯酶@ZIF-8-CA的活性归一化为100%。相对活性根据乙酰胆碱酯酶@ ZIF-8-钙的最高活性进行标准化。数据表示为平均值±标准差；n = 3个独立样本。
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石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶@ ZIF-8-钙的抑制作用。(B)石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶@ ZIF-8-钙的抑制曲线。数据表示为平均值±标准差；n = 3个独立样本。
相关成果以“In Situ Biomineralization and Citric Acid Etching Strategy for Enhancing Activity of Immobilized Acetylcholinesterase”，发表在国际学术期刊“Langmuir”上。
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https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.4c02852
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