准确有效地确定抗生素耐药性对于限制传染病的传播和确保人类健康至关重要。在此，一种简单、准确和高通量的基于噬菌体的比色传感策略被开发用于抗菌药物敏感性测试(AST)。利用CRISPR/Cas9系统，对T4噬菌体的基因组进行模块化改造，使其携带lacZ-α (lacZa)，一种编码β-半乳糖苷酶(β-gal)α片段的标记基因。通过蓝白色选择鉴定T4lacZa噬菌体，然后用于生物传感应用。在这种策略中，细菌溶液暴露于T4lacZa噬菌体，导致靶细菌过表达β-gal。添加比色底物后，β-gal会引发酶促反应，导致溶液颜色从黄色变为红色。这种传感策略提供了一种在存在抗生素的情况下监测细菌生长的可视化方法，从而能够确定细菌的抗微生物敏感性。作为概念验证，我们开发的传感策略成功地应用于识别尿液样本中9种不同的多药耐药大肠杆菌(大肠杆菌),具有100%的特异性。与传统的纸片扩散药敏试验相比，基于噬菌体的基因工程传感策略可以在不损失检测灵敏度的情况下将检测时间缩短至少一半，为ast的临床诊断提供了一种高通量的替代方法。![]()
CRISPR/Cas9介导的T4噬菌体基因组编辑用于细菌比色检测概述。(1)t4wt噬菌体通过CRISPR/Cas9系统用lacZa基因工程化。含有Cas9质粒和供体质粒大肠杆菌菌株在体内表达Cas9/sgRNA复合物。在噬菌体感染期间，噬菌体基因组被Cas9/sgRNA复合物切割，然后触发断裂的噬菌体基因组和供体质粒的同源臂之间的同源重组，产生重组噬菌体(T4lacZa噬菌体)。(T4lacZa噬菌体用于进一步检测细菌。T4lacZaphages的感染触发噬菌体繁殖和β-半乳糖苷酶(β-gal)的过表达。随后，T4lacZa噬菌体和β-gal在细胞裂解时被释放。(3)检测信号是在β-半乳糖与氯酚红-β-d-吡喃半乳糖苷(CPRG)的酶促反应下产生的。检测结果可以通过比色信号来确定。
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利用CRISPR/Cas9系统构建T4lacZa重组噬菌体。(a)同源重组的示意图。(b)仅含Cas9质粒的大肠杆菌的T4WT噬菌体感染。(c)仅含供体质粒的大肠杆菌的T4WT噬菌体感染。(d)含有Cas9质粒和供体质粒的大肠杆菌的T4WT噬菌体感染。(e)来自各种感染情况的噬菌体噬斑。(f)各种感染情况下的平板接种效率。(g)用仅含供体质粒的大肠杆菌感染后噬菌体噬斑的表征。(h)用含有Cas9质粒和供体质粒的大肠杆菌感染后噬菌体噬菌斑的表征。
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T4lacZa重组噬菌体的鉴定。(a)工程噬菌体蓝/白选择的工作流程。(b)工程噬菌体的蓝/白选择照片。(T4WT和T4lacZa噬菌体对大肠杆菌细胞的抑制作用。(T4WT和T4lacZa噬菌体的一步生长曲线。
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用T4lacZa噬菌体比色检测大肠杆菌。(a)用于检测大肠杆菌的比色生物传感器的原理示意图。感染3小时(b)、4小时(c)和5小时(d)的反应溶液的数码照片。感染后3小时(e)、4小时(f)和5小时(g)的比色反应热图。基于573 nm处吸光度强度的比色反应(A573)。
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使用T4lacZa噬菌体进行高通量抗菌药物敏感性试验。(a)尿样中比色AST的工作流程。(b–k)抗菌药物敏感性测试结果的照片和雷达图。细菌从左至右为:(b)野生型大肠杆菌(阳性对照)，(c)氨苄青霉素抗性大肠杆菌，(d)卡那霉素抗性大肠杆菌，(e)氨苄青霉素和氯霉素抗性大肠杆菌，(f)氨苄青霉素和壮观霉素抗性大肠杆菌，(g)卡那霉素和氯霉素抗性大肠杆菌，和(h)氯霉素和壮观霉素抗性大肠杆菌(I)庆大霉素和壮观霉素抗性大肠杆菌(j)卡那霉素和壮观霉素抗性大肠杆菌(j)通过将实验组的A573除以阴性对照组的A573来计算该值。细菌的浓度是106CFU/mL，而噬菌体的浓度是103 PFU/mL。所有实验重复三次。
相关成果以“CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of T4 Bacteriophage for High-Throughput Antimicrobial Susceptibility Testing”，发表在国际学术期刊“Analytical Chemistry”上。
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https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c05177
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