CRISPR/Cas12a技术自从发现其不分青红皂白的侧枝裂解活性以来，已被证明是一种强大的分子诊断工具。各种CRISPR/Cas12a集成方法，包括荧光，电化学，比色，和磁弛豫开关生物传感器，已被开发用于检测病原菌，病毒，小分子，等。在这些输出中，具有高选择性、简单性和快速性等优点的荧光获得了相当大的科学关注。在典型的CRISPR/Cas12a荧光法中，TaqMan荧光探针，一种在两端用荧光团和淬灭剂标记的单链DNA（ssDNA）被用作反式报告员。在被靶DNA激活后，Cas12a降解ssDNA片段，介导“荧光-on”。然而，这种TaqMan基质介导的CRISPR/Cas12a荧光法由于裂解速率相对较慢，不足以进行早期低丰度检测，因此只能实现纳米摩尔水平的灵敏度。为了解决这一问题，一些目标前置放大或级联信号放大策略已被纳入CRISPR/Cas12a中进行放大检测。尽管如此，这些方法呈现出要么是气溶胶污染，要么是复杂信号转导的两难境地，阻碍了其进一步的广泛应用。因此，仍然迫切需要一种具有高灵敏度、简单性和抗污染性的先进CRISPR/Cas12a荧光方法。框架核酸由多条DNA链组成，是一类自组装、形状可控的纳米材料，具有无与伦比的优点，如可编程性、成本有效性和精确寻址性。这些特性推动了它在同质、异质、和细胞内生物传感中的应用。目前，一些框架核酸，如三角形棱柱、四面体、和DNA折纸，已经通过“自下而上”组装设计出来。特别是，由4-8股ssDNA链组成的四面体框架发现了其独特的优势。四面体DNA框架中的每条链都可以通过嵌入特定的核酸序列来定制以展示精致的功能。此外，四面体DNA纳米载体的扩展顶点可以提高可及性和杂交效率，为加速与他人的接触和接触提供了巨大的希望。DNAzyme，也称为脱氧核酶或DNA酶，是一种由单链寡核苷酸自然形成的真正的催化酶。通常，以特定的阳离子作为辅因子，DNAzyme可以折叠成复杂的三维纳米结构，用于催化各种生化反应，如切割、连接、和磷酸化。考虑到其成本有效性、高催化效率和优异的稳定性，DNAzyme已成为生物结合、体外生物传感、和体内基因沉默的强大工具。在无数报道的DNAzyme中，值得一提的是CLICK-17 DNAzyme，它可以催化叠氮炔环加成，使用Cu（II）或Cu（I）作为独家辅因子。与传统的Cu（I）催化点击化学相比，这种CLICK-17 DNAzyme触发的点击化学不仅避免了显式还原剂的必要性，而且避免了剧毒活性氧的产生，为生物传感应用提供了重要的前景。受上述结果的启发，我们通过创造性的DNAzyme嵌入框架核酸（FNAzyme）底物提出了一种增强的CRISPR/Cas12a荧光方法。通过将四个CLICK-17 DNAzymes嵌入刚性四面体支架中，设计了具有四个相同吊坠的FNAzyme，目的是发挥双重功能。一方面，利用FNAzyme通过四面体提高Cas12a和反式底物之间的局部密度和暴露机会，从而加速Cas12a的反式切割效率。另一方面，FNAzyme的DNAzyme部分在Cu（II）的作用下催化3-azido-7-hydroxycoumarin（AHC）和3-丁烷-1-ol（BOL）之间的点击反应，产生放大的荧光信号，在360nm处发出蓝光（图1A）。以methicillin-resistant金黄色葡萄球菌（MRSA）为模型靶点，在MRSA存在下，MRSA与适配体之间的相互作用可以诱导活化剂的释放，从而刺激Cas12a切割FNAzyme底物。因此，CLICK-17 DNAzyme的降解阻碍了点击反应的启动，导致“荧光关闭”信号（图1B）。该方法将基于功能核酸的识别模块与双功能FNAzyme介导的扩增模块集成在一起，提供了一个无提取、无扩增、敏感和模块化的检测平台。![]()
相关成果以“Enhanced CRISPR/Cas12a Fluorimetry via a DNAzyme-Embedded Framework Nucleic Acid Substrate”，发表在国际学术期刊“Analytical Chemistry”上。
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https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c04710
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