核酸的快速和可靠的检测和定量对于包括传染病和癌症诊断在内的各种应用是至关重要的。虽然常规方法，如定量聚合酶链反应被广泛使用，但由于其复杂性和对精密设备的要求，它们被限制在实验室环境中。在这项研究中，我们提出了一种新的无扩增数字传感策略，将Cas12a酶的侧链切割活性与单次冲击电化学相结合。在这样做的过程中，我们使用直接的温度辅助共功能化过程来修饰银纳米粒子，以随后检测由活化的Cas12a释放的粒子的碰撞事件，作为微电极阵列上不同的电流尖峰。该功能化产生稳定的DNA-AgNP缀合物，使它们适用于许多生物传感器应用。因此，我们的研究证明了基于聚类的规则间隔短回文重复序列的诊断与基于冲击的数字传感相结合的快速无扩增核酸定量的潜力。
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基于单次冲击电化学的无放大数字CRISPR供电生物传感器概念。该分析包括(I)由与MBs连接的DNA-agnp组成的报道复合物，(ii)crRNA/cas 12a复合物，和(iii)可能含有靶序列的样品。在靶存在的情况下，Cas12a的侧链切割活性导致DNA-AgNP-MB报道复合物的切割。磁性分离后，释放的DNA-agnp被施加到偏置的MEA上，并且发生颗粒氧化。超过25 pA阈值的电流峰值被视为有效的AgNP影响。相比之下，如果目标序列缺失，Cas12保持不活动，报告复合物保持完整&没有粒子释放，因此看不到任何影响。
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AgNP的冷冻定向共功能化导致稳定的DNA-AgNP缀合物。(a)将生物素化的T-接头(100 nt)和T-间隔基(5 nt)与20 nm AgNP以10∶2000∶1的摩尔混合比混合。冷冻后，由于冰晶的形成，DNA排列整齐并局部浓缩——通过巯基发生共价结合。成功的DNA附着由(b)局部表面等离子体共振(LSPR)峰(UV/vis)的红移，(c)更大的流体动力学直径[动态光散射(DLS)]，和(d)ζ电势的变化来指示。误差线代表平均标准偏差，其中n = 3。(e)生物素/T-间隔基-agnp在500 mM NaCl中< 45分钟没有显示出聚集迹象。
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磁性下拉概念的表征和优化。(a)需要T-间隔壳来防止柠檬酸盐封端的AgNPs聚集和吸附到MBs上。即使在T-间隔基/MB体积比为1∶1的情况下，成功的DNA附着也保护了AgNPs，因为幅度没有降低，所以看不到聚集/吸附的迹象。(b)测试每个AgNP的不同生物素化T-接头比率，并测量上清液的UV/vis光谱。需要10:1的比例，以确保几乎每个颗粒都获得至少一个T-接头，因此在与MB结合后被拉下。(c)通过将功能化颗粒与MBs以不同的混合比孵育来确定MBs上的DNA-AgNP负载量。此外，组装的报道复合物的稳定性在冰箱中的去离子水中测试1周。
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UV/vis读数证实了使用DNA-AgNP-MB报道复合物的磁性下拉分析的概念。最大的动态范围来自15和30分钟的孵育时间。
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使用不同目标浓度的无放大数字CRISPR供电生物传感器概念的单次冲击读数的代表性电流轨迹。(a)在检测缓冲溶液中的记录显示没有AgNP影响，支持25 pA的保守电流阈值。(b)对照实验，使用随机序列(DNA 1)激活RNP复合物，导致单一尖峰，可能是由于报道复合物降解。(c–e)通过增加目标浓度，可以相应地计算更多AgNP影响。图S7中绘制了放大图，以显示检测阈值和(d，e)中所示的放大器相关振铃效应。所有记录都是在含有200 mM KCl/50 mM KOH的200 μL总体积中进行的，微电极相对于Ag/AgCl偏置到1 V。
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无放大数字CRISPR供电生物传感器概念的校准曲线。
相关成果以“Digital Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Powered Biosensor Concept without Target Amplification Using Single-Impact Electrochemistry”，发表在国际学术期刊“ACS Sensors”上。
文献链接：点击阅读原文
https://doi.org/10.1021/acssensors.4c02060
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