可视化动脉内脂质的定位和分布对于研究动脉粥样硬化至关重要。然而，现有的脂质特异性探针面临着诸如强疏水性和亲脂性细胞器或组织的非特异性染色等挑战，使得它们对于动脉粥样硬化斑块的精确识别不切实际。为了解决这个问题，我们设计了一种协同激活的探针，Cbz-Lys-Lys-TPEB，它响应组织蛋白酶B（CTB）和H2O2原位生成聚集诱导发射发光体（AIEgens）。这使得动脉内脂质的特异性染色和动脉粥样硬化斑块的精确成像成为可能。该探针将四苯基乙烯构建块与亲水性肽序列（Cbz-Lys-Lys）和苯硼酸模块相结合，在分子分散状态下提供出色的水溶性和荧光淬灭。在斑块内与H2O2和CTB相互作用后，亲水性Cbz-Lys-Lys-TPEB探针被特异性切割并转化为疏水性AIEgens，导致快速聚集和显著的荧光增强。有趣的是，原位释放的AIEgens显示出独特的脂质结合能力，有效地跟踪斑块中脂质的位置和分布。这种协同靶向激活的AIEgen释放策略证明了可靠和准确识别动脉粥样硬化斑块的显著可行性，在动脉粥样硬化的临床诊断和风险分层方面具有巨大潜力。![]()
(A) H2O2和CTB活化和脂质染色探针的分子设计。(B)由H2O2和CTB同时激活的亲水性Cbz-Lys-Lys-TPEB探针的图示，用于原位产生脂质特异性抗原和精确鉴定动脉粥样硬化斑块
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(A)有和没有H2O2和CTB的Cbz-Lys-Lys-TPEB的紫外-可见吸收光谱。(B)通过H2O2和CTB活化的Cbz-Lys-Lys-TPEB (50微米)的荧光光谱。插图:(a) Cbz-Lys-Lys-TPEB，(b) Cbz-Lys-Lys-TPEB + H2O2，(c) Cbz-Lys-Lys-TPEB + CTB，以及(d) Cbz-Lys-Lys-TPEB + H2O2+CTB在紫外光(365 nm)下的照片。(C)在H2O2 (300微米)和CTB (3微克/毫升)共存时，Cbz-Lys-Lys-TPEB (50微米)的随时间变化的荧光光谱。(D)在H2O2和CTB存在下，具有不同孵育时间的Cbz-Lys-Lys-TPEB在600 nm的荧光强度图。(E)在固定浓度的H2O2 (300微米)下，用不同浓度的CTB孵育，Cbz-Lys-Lys-TPEB (50微米)的荧光光谱。(F)在固定浓度的CTB (3 μg/mL)下与不同浓度的H2O2一起温育的Cbz-Lys-Lys-TPEB (50微米)的荧光光谱。λex = 405 nm。
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（A）ox-LDL触发的H2O2、CTB和脂质的上调。（B）Cbz-Lys-Lys-TPEB（20μM）处理的RAW 264.7巨噬细胞在不同刺激和相对荧光强度下的共聚焦荧光成像。数据显示为平均值±SD（n=3）。***p<0.001（n=3）。
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RAW 264.7巨噬细胞与Cbz-Lys-Lys-TPEB共孵育的共定位图像（20μM，Ex=405 nm，从540至610 nm收集），绿色通道的相应商业细胞器跟踪器（Nile Red，0.5μM，Ex=561 nm，从620至660 nm收集；MitoTracker Green，1μM，Ex=488 nm，从500至530 nm收集；LysoTracker Green，1μM，Ex=488 nm，从490至520 nm收集；Hoechst 33342,8μg/mL，Ex=405 nm，从430至480 nm收集），以及Cbz-Lys-Lys-TPEB与商业细胞器跟踪器的相应重叠曲线。
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(A)ox-LDL刺激的巨噬细胞转化为泡沫细胞的分子机制示意图，其中H2O2、CTB和脂质异常表达。(B)分别用桃红H2O2探针、魔红和尼罗红对细胞中的H2O2、CTB和脂质染色的水平进行共聚焦成像。(C)蛋白质印迹分析以研究NADPH氧化酶、CTB和ACAT1蛋白的表达。(D)通过蛋白质印迹实验研究不同处理的巨噬细胞中NADPH氧化酶蛋白水平。(E)使用过氧化氢荧光测定试剂盒分析经各种处理的巨噬细胞中的细胞内H2O 2含量。(F)用魔红染色法分析不同处理的巨噬细胞中的CTB表达。(G)ox-LDL刺激的巨噬细胞、ox-LDL和夹竹桃素共培养的巨噬细胞以及用Cbz-Lys-Lys-TPEB探针处理的巨噬细胞和夹竹桃素预处理的巨噬细胞的共聚焦成像。(H)图像的相对荧光强度(F)。(I)图像的相对荧光强度(G)。数据显示为平均值±标准差(n = 3)。
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(A)说明健康和动脉粥样硬化小鼠模型的过程。(B)来自(a)喂食HFD 12周的C57BL/6J和(b) C57BL/6J小鼠和(c)喂食HFD 12周的ApoE –/–小鼠的主动脉的代表性油红O染色图像。(C)小鼠血清中CHO、TG、LDL和HDL的含量。(D)小鼠主动脉中Cbz-Lys-Lys-TPEB探针的体外荧光成像。(E)图像的相对荧光强度(D)。数据显示为平均值±标准差(n = 3)。*p < 0.05和**p < 0.01 (n = 3)。(F)Cbz-Lys-Lys-TPEB探针在小鼠不同器官中的生物分布。
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(A)在静脉注射Cbz-Lys-Lys-TPEB 4小时后12周，从ApoE –/–HFD小鼠切除的主动脉的代表性冷冻切片的油红O染色和共聚焦成像。(B)主动脉冷冻切片中的油红O染色图像和Cbz-Lys-Lys-TPEB荧光成像，以及虚线框所示区域的放大图像。红色通道来自Cbz-Lys-Lys-TPEB，绿色通道来自尼罗红。(C)分别来自(B)中重叠图像的Cbz-Lys-Lys-TPEB与尼罗红的对应重叠曲线。
相关成果以“Synergistically Activated Aggregation-Induced Emission Probe for Precise In Situ Staining of Lipids in Atherosclerotic Plaques”，发表在国际学术期刊“Analytical Chemistry”上。
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https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c04559
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