谷物中真菌毒素的出现在世界各地都很普遍。然而，缺乏高效和超灵敏的测试极大地阻碍了实际样品中这些物质的鉴定。本文报道了一种新的一锅等温检测方法，该方法结合滚环扩增(RCA)和CRISPR/Cas12a检测黄曲霉毒素B1 (AFB1)。在将AFB1添加到用AFB1适体及其互补DNA (cDNA)的双链体功能化的磁珠上时，适体对AFB1的特异性识别导致cDNA的释放以激活RCA反应。随后，RCA扩增子启动核酸内切酶Cas12a的反式切割和顺式切割活性。RCA和CRISPR/Cas12a的协同偶联能够实现cDNA的指数扩增，这进一步促进CRISPR/Cas12a非特异性切割具有增强的检测信号的单链DNA报道基因。值得注意的是，CRISPR/Cas12a辅助的一锅等温检测不仅可以通过荧光检测实现超灵敏的定量检测，还可以通过侧流条实现可视化检测，从而提高了资源有限地区真菌毒素检测的可及性。检出限分别为0.016和0.408 ng/mL。该方法成功应用于实际样品，回收率为90-114%。这项研究为各种应用中的真菌毒素的可靠和超灵敏检测提供了一种强大和通用的方法。
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用于检测AFB1的基于荧光的CRISPR/Cas12a辅助的一锅等温分析的示意图。
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基于荧光的CRISPR/Cas12a辅助的一锅等温检测AFB1的可行性。(a)从特异性af B1/适体识别中释放cDNA的示意图。(b)显示af B1/适体识别特异性的荧光光谱。(c)具有不同变量的一锅等温分析的荧光强度。误差线代表标准偏差(n = 3)。
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基于荧光的CRISPR/Cas12a辅助的一锅等温测定的条件优化:(a)split r连接酶，(b)挂锁探针，(c) phi29聚合酶，(d) RNP，(e) ssDNA报道基因，和(f)一锅等温测定的反应时间。误差线代表标准偏差(n = 3)。
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基于荧光的CRISPR/Cas12a辅助一锅等温分析的灵敏度和选择性。(a)荧光强度与从0.05到50纳克/毫升的各种AFB 1浓度相关。插图显示了荧光强度和lg CAFB1之间的线性关系。(b)不同真菌毒素的选择性试验。误差线代表标准偏差(n = 3)。
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CRISPR/Cas12a辅助的一锅等温策略与横向流动条(CRISPR/Cas12a-LFS)相结合。(a)用于检测AFB1的CRISPR/Cas12a-LFS方法的示意图。(b)引入不同浓度AFB1的LFS结果的图片。(c)T/c值和AFB1浓度之间的相关性。插图说明了T/C值和log CAFB1之间的线性关系。(d)不同真菌毒素的选择性测试。实验中使用的所有真菌毒素的浓度均为10纳克/毫升。误差线代表标准偏差(n = 3)。
相关成果以“Highly Sensitive One-Pot Isothermal Assay Combining Rolling Circle Amplification and CRISPR/Cas12a for Aflatoxin B1 Detection”，发表在国际学术期刊“Analytical Chemistry”上。
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https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03798
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