化疗耐药性仍然是限制癌症患者临床结果的主要障碍。它是指癌细胞通过各种机制抵抗化疗药物而存活的先天和/或后天能力。除了已经建立的抗性途径，例如药物摄取减少和药物流出增加，细胞衰老，一种稳定的细胞周期停滞状态，已经越来越被认为是驱使癌细胞逃避化疗诱导的细胞凋亡的关键介质。此外，这些衰老细胞表现出高代谢活性并分泌多种因子，称为衰老相关分泌组，导致周围细胞中的衰老传播和肿瘤微环境的重塑，通过自分泌和旁分泌途径促进癌症转移、复发和对治疗的不良反应。因此，监测化疗诱导的衰老(CIS)不仅对深入理解治疗耐药性和异质性的适应机制至关重要，而且对有效的癌症管理提供指导。分子成像是对生命系统中各种生物事件进行原位纵向可视化的不可或缺的技术。事实上，在过去的几年里，人们对开发用于细胞和动物模型衰老成像的衰老探针越来越感兴趣。现有的senoprobes主要是通过监测衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性来设计的，SA-β-gal是目前衰老的金标准生物标志物。然而，β-gal在某些条件下的表达，尤其是癌基因相关的β-gal，可能不可避免地产生假阳性或不可分辨的成像信号。迄今为止，顺式负荷的精确成像仍然是一个巨大的挑战，因为缺乏单一的衰老特异性标记和以高灵敏度、选择性和广谱适用性读出这些标记的非侵入性策略。在许多生物过程中，细胞内铁代谢对于维持代谢稳态和功能至关重要。积累的证据证明，铁稳态失调与年龄相关的疾病密切相关，如心血管疾病，神经退行性疾病，器官功能障碍，和糖尿病。最近，铁过载被证明是正在衰老的细胞的固有特性，表明其作为细胞衰老的有希望的目标的潜力。然而，基于铁成像的细胞衰老无创检测方法仍然非常罕见。即使在这些为数不多的研究中，选择性检测癌症衰老的可行性仍不清楚。这种限制可归因于两个方面:(I)在癌症中经常发现铁代谢增加，以支持快速的细胞代谢和增殖，使得对衰老癌细胞相对于非衰老状态的选择性成像具有挑战性；(ii)尽管不稳定铁库的水平增加，但大多数铁以铁蛋白结合的形式存在，由于细胞衰老期间自噬-溶酶体途径受损，这是一种逃避铁下垂的自我保护机制，这给传统铁成像探针的性能造成了很大的障碍，随后导致区分衰老和非衰老癌细胞的灵敏度不足。迄今为止，能够对癌症中衰老相关的铁稳态失调进行敏感和选择性成像的策略仍然难以捉摸。在此，我们构思了一种适应细胞衰老独特特征的空间选择性自放大成像策略，并报道了一种新的可活化聚合物纳米探针，用于癌症中CIS的高灵敏度和选择性成像。如方案1所示，这种纳米探针(PF-Torin1-Ferro)整合了三个关键部分:作为空间响应载体的氟化两亲聚合物，作为信号报告分子的亚铁离子(Fe2+)-可活化染料(FerroOrange)，以及作为信号放大器的自噬诱导物(Torin1)。由于在细胞衰老过程中溶酶体含量增加，PF-Torin1-Ferro在衰老癌细胞中比在非衰老癌细胞中表现出优先摄取和溶酶体定位。内化后被溶酶体SA-β-gal原位水解，释放出铁橙和Torin1。铁橙将被不稳定的Fe2+激活，并产生“关-开”荧光信号。此外，Torin1是一种抑制剂，可以抑制mTOR诱导自噬，从而促进衰老细胞中积累的铁蛋白的自噬降解，释放更多的Fe2+，进而增强铁橙的荧光信号，提高信号与背景的比率。此外，纳米探针的积累和激活以及铁蛋白降解发生在相同的亚细胞位置，这可以最小化扩散过程诱导的非特异性反应，从而允许成像期间的高空间选择性。由于这些优点，PF-Torin1-Ferro已成功应用于不同类型的癌细胞系和动物模型中CIS的非侵入性监测。这项研究提供了一个很好的例子，说明如何利用衰老细胞中独特但普遍存在的代谢障碍来精心构建先进的成像工具，这些工具有望显著扩展癌症生物学和干预中细胞衰老生物学功能的基础研究。![]()
癌细胞中（A）增殖状态和（B）衰老状态下铁蛋白自噬过程的示意图。（C）用于空间选择性和自放大成像的定制纳米探针（PF-Torin1-Ferro）的潜在分子机制示意图。
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特制可活化纳米探针的合成与表征。（A）化合物9（PF）的合成路线。（i）溴化炔丙基，Al，HgCl2，THF。（ii）Ag2CO3，HMTTA，1-溴-（2,3,4,6-O-四乙酰基）-alpha-d-galactopyranoside，CH3CN，rt。（iii）吡啶，氯甲酸对硝基苯酯，CH2Cl2，rt。（iv）（5-氨基-1,3-亚苯基）二甲醇，HOBT，DMF，50°C，3 h。（v）4-硝基苯基氯甲酸酯，吡啶，CH2Cl2，rt。（vi）3,5-双（三氟甲基）苄胺，HOBT，三乙胺，CH2Cl2，rt，过夜。（vii）CH3OH，CH2Cl2，甲酸钠，0°C。（viii）mPEG2000-N3，CuSO4·5H2O红色箭头表示与β-gal孵育后PF胶束的不规则聚集。（F）PF胶束与β-gal（2U）孵育12小时前后的HPLC谱（检测波长：260nm）。（G）在37℃下无β-gal（2U）和存在β-gal（2U）时尼罗河红胶束的时间依赖性释放谱。
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不同化疗药物引起的癌细胞中CIS的表征。（A）肌动蛋白细胞骨架染色图像，（B）SA-β-gal染色图像，和（C）增殖A549细胞（Pro）和A549细胞用不同药物包括DOX、5-FU、OX、PTX和CPT处理的EdU染色图像。（D）不同药物处理的对照A549细胞（Pro）和A549细胞中铁蛋白相对于β-actin的表达的Western blot分析。（E）面板（D）中不同组铁蛋白相对蛋白表达的相应定量。数据代表从平行孔收集的细胞中的平均蛋白质水平。
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用工程化纳米探针对癌细胞中chemotherapy-induced细胞衰老的自放大成像。（A）用尼罗蓝负载PF胶束（尼罗蓝为1.5μg/mL）和LysoTracker Green（50 nM）处理的增殖A549细胞和DOX诱导衰老A549细胞的共定位荧光成像。（B）PF-Ferro和PF-Torin1-Ferro（FerroOrange为1μM）分别孵育8小时后，治疗诱导增殖A549细胞和DOX诱导衰老A549细胞中细胞衰老的示意图和（C）共聚焦荧光成像。（D）面板（C）的定量荧光分析。（E）用游离Torin1（250 nM）和FerroOrange（1μM）处理后增殖A549细胞和DOX诱导衰老A549细胞中治疗诱导细胞衰老的示意图和（F）共聚焦荧光成像。（G）面板（F）定量荧光分析根据四张图像计算数据，显示为平均值±SD（n=4）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns：无显著性。
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用工程纳米探针放大成像癌细胞中chemotherapy-induced细胞衰老的机制研究。（A-D）免疫印迹分析（A）铁蛋白、（B）TfR1、（C）microtubule-associated蛋白轻链3（LC3-I至LC3-II，自噬体标记）和（D）NCOA4相对于β-肌动蛋白在增殖A549细胞（Pro）和DOX诱导的衰老A549细胞（Sen）中的表达，与不处理PF-Torin1相比，浓度为2μg/mL Torin1 4小时。（E）定量分析面板中不同组的相对蛋白质水平（A-D）。数据代表从三个平行孔收集的细胞中的平均蛋白质水平。（F）测量增殖A549细胞和DOX诱导的衰老A549细胞中的溶酶体pH值，与不处理PF-Torin1相比。数据显示为平均值±SD（n=4）。*P<0.05和ns：无意义。（G）拟议的纳米探针通过特异性逆转senescence-associated受损的铁蛋白吞噬，用于A549细胞中治疗诱导的细胞衰老的自放大成像的基本机制的示意图描述。
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工程化纳米探针在化疗诱导的癌症衰老中的体内成像性能。(A)治疗诱导的癌症衰老动物模型的建立和治疗过程的示意图。(B)从非衰老和阿霉素诱导的衰老肿瘤中采集的肿瘤组织的代表性 SA-β-gal 染色图像。(C)从非衰老和阿霉素诱导的衰老肿瘤中采集的肿瘤组织的代表性 LMNB1 染色图像。(D)从非衰老和阿霉素诱导的衰老肿瘤中采集的肿瘤组织的代表性 H&E 染色图像。(E)非衰老和阿霉素诱导的衰老 A549 荷瘤小鼠在不同时间间隔下用 PF-Ferro 与 PF-Torin1-Ferro（FerroOrange 为 4nmol，Torin1 为 3.8μg）处理后的荧光成像。
相关成果以“Spatially Selective Self-Amplified Imaging of Chemotherapy-Induced Cancer Senescence via Reversal of Impaired Ferritinophagy”，发表在国际学术期刊“Analytical Chemistry”上。
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https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c02543
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