在冷冻电镜技术的应用中，电子直接探测相机（electron direct detection device，简称 DDD）的出现，使得高分辨率结构研究变得更加简便且广泛应用。这项技术的革新为科学研究带来了巨大的突破。本文将详细介绍 DDD 相机的工作原理和技术优势，并分享其在解决冷冻电镜技术难题方面的具体应用。此外，我们将展望 DDD 相机在未来可能为冷冻电镜技术应用带来的突破性进展。
DDD 相机常用的成像模式主要包括三种：积分模式 (integrating mode)、计数模式 (counting mode) 和超分辨率模式 (super-resolution mode)。
用户可根据自身需求和计算设备的图像处理能力，选择最佳的成像模式。这些模式的共同优点是可以通过视频模式 (movie mode) 对同一区域进行多帧成像，然后结合图像处理软件，校正由于电子束相互作用或样品台不稳定带来的成像漂移。
DDD相机的技术优势
对单颗粒技术的促进
DDD 相机的应用显著促进了单颗粒技术的发展。对于高对称性样品而言，使用 DDD 相机进行数据收集不仅能获取高分辨率图像，还显著减少了所需的样品颗粒数和数据采集时间。
对冷冻电子断层技术的促进
电子断层成像对单个对象（例如病毒、细菌、复合物和细胞等）从多个角度进行二维成像，并整合重构成三维结构图。在研究非定形、不对称或不具全同性的生物样品的三维结构和功能方面，电子断层成像具有不可替代的重要角色。不过，由于需要对同一区域进行多次曝射，增加了电子剂量，可能会导致电子损伤。
对二维高分辨成像的促进
在二维高分辨率成像方面，传统的超薄切片技术通常依靠固定、脱水和包埋等化学处理，以及化学染色来增强图像反差。然而，这些处理方法可能会损坏样品并在电镜下形成假象，同时分辨率也仅能达到几个纳米的水平。
后来冷冻超薄切片技术逐渐成熟，使生物材料快速冰冻法固定和在－185～－15℃环境下进行超薄切片成为可能，从而使水合样品得以保持或接近其原始活体状态，防止可溶性物质的抽取、流失和移位，保持了生物大分子的活性，并大大缩短了样品的制备时间。
配准平均处理前后的轮状病毒冷冻电镜图(DE12 相机)
(A) 没有配准、直接叠加的图像模糊，边缘不清；
(B) 配准处理后再叠加的图像清晰，病毒突起明显。图修改自参考文献，标尺为 50 nm
结合 DDD 相机，冷冻电镜技术大大提升了高分辨率结构的解析能力。它不仅能够解析高对称性样品，还可以应用于没有对称性的样品，并进一步降低了研究对象的分子量下限，使得难以结晶的蛋白质（如生物体内非常重要的膜蛋白等）的结构解析变得更为顺利。冷冻电子显微镜 (Cryo-EM) 技术通过将样品在低温下快速冷冻，使其处于无定形玻璃态冰层内，同时减少了电子辐射的破坏。这一技术在保障高真空度要求的同时，成为高分辨率观察水合样品原始结构的最先进手段，广泛应用于生物和材料等领域。
著名结构生物学家 Rossmann 也指出，由于成熟的 DDD 相机的应用，冷冻电镜技术正逐渐成为结构生物学研究的主要工具。因此，我们有理由相信，这一结构解析方法将在生物学领域发挥更为重要的作用。
引用：柳正,张景强.结构生物学研究方法的重大突破——电子直接探测相机在冷冻电镜中的应用[J].生物物理学报,2014,30(06):405-415+402.
据悉，水木未来将要发布其冷冻电镜解决方案，业界期待中；
透射电镜科普：TEM中的明场像和暗场像
什么是明场像、暗场像？
●明场像：用物镜光阑选择透射束成像时，获得的电子显微像称为明场像（BF：bright field image）
●暗场像：通过移动物镜光阑选择一个衍射束成像称为暗场像（DF：dark field image）
●中心暗场像：如果保持物镜光阑孔位于光轴上，用偏转线圈将选定的衍射束偏转到荧光屏中心，令其通过物镜光阑形成的像是中心暗场像（CDF：center bright field image）
透射电子显微像观察中用物镜光阑确定成像的电子束
（备注：物镜光阑位于物镜后焦平面上，可以遮挡散射电子而提高试样像的衬度。）
明、暗场像的衬度是相反的？
●通常情况下，在明场下，满足布拉格衍射条件的位置为暗的衬度，而不满足布拉格衍射条件的位置为亮的衬度。
●而在暗场下，暗场像的衬度与对应选择的衍射束有关；如果采用任意一个弱的衍射束（即偏离布拉格条件比较远的衍射束）用于形成暗场像，则并非所有部分的衬度都是相反的。
●值得注意的是，如果接近理想双束条件，即除透射束外，仅有一束强衍射束，则此衍射束强度与直射束强度之和近似等于入射电子束强度。此时，明、暗场像的强度近似为互补关系。
我们常说：一个晶粒内，双束衍射条件下，明场像与暗场像的衬度恰好相反。
明场像有什么作用？
●形貌观察是TEM中最基本的测试项目，且一般使用明场像进行形貌观察。
明场像中晶粒的衬度与晶粒取向有关，而一般情况下相邻晶粒之间的晶体取向是不同的，因此不同的晶粒有不同的衬度，所以在明场像中能够得以区别不同的晶粒，从而可以进行晶粒尺寸统计。
●当晶体中存在畸变时，晶内某些区域的晶体学取向会发生微小的变化，从而在明场像中产生衬度上的差别。
因此利用明场像可以观察点缺陷、线缺陷（位错）、面缺陷（孪晶、层错）等。
●基体和第二相的衍射条件一般也是不同的，因此稍有经验的研究人员，可以在明场像中观察第二相的分布和第二相的尺寸。
当然，如果样品是纯非晶态，则不存在衍射衬度或取向衬度，只有质厚衬度。
暗场像有什么作用？
●利用暗场像，可对晶体缺陷或第二相成像。
●利用暗场像，可统计晶粒尺寸，特别是塑性变形产生的细晶结构，因畸变严重，明场像下晶粒形貌不明显，利用暗场成像则能更准确地统计晶粒尺寸。
