基因改造的光脱卤酶催化芳香卤代物的脱卤氘代反应
文摘
科学
2023-04-22 08:34
浙江
导读：
近期，华中科技大学钟芳锐和中科院生物物理所王江云课题组合作发表在《Chem》的一篇文章报道了一种编码在黄色荧光蛋白（sfYFP）中的二苯甲酮光催化剂，作为还原光卤化酶（RPDase）可以催化芳香卤化物的脱卤（氘代）反应。RPDase通过非天然脱卤还原机制，以甲酸钠作为牺牲还原剂，兼容各种芳基卤化物，并且适用于氘代药物分子的合成和形成C-C键的自由基加成反应。作者首次实现通过使用表达RPDase的重组大肠杆菌细胞进行全细胞光生物催化。自然进化的过程中在分子水平产生了具有结构和功能多样性的酶。例如，卤代芳烃通常是有毒有害的，可被有机卤化物呼吸细菌有效降解，其中编码脱卤酶的基因已经被鉴定。大自然可以根据底物的类型创造不同的脱卤酶，尽管天然脱卤酶的催化机制多种多样，但仍然受到天然辅因子和天然氨基酸种类的限制。如用于降解四氯乙烯的天然钴酰胺（维生素B12）由于Co(Ⅱ)/Co(Ⅰ)氧化还原电位较低和底物特异性使得很难处理高抗还原活性的芳基卤化物。将合成辅因子引入天然蛋白质赋予酶新的化学反应活性，设计人工脱卤酶，可以利用非天然催化剂的反应性来进行合成化学中发展的脱卤（氘代）反应，从而实现高价值的化学合成。王江云课题组曾基于基因密码子扩展技术实现了多种具有特殊物理化学性质的非天然氨基酸在蛋白质中的编码。作者前期研究发现通过使用基因密码子扩展技术可以将二苯甲酮非天然氨基酸插入荧光蛋白，从而改造发色团光驱动生成具有高还原活性的物种，用于镍催化CO2光还原，芳香卤化物的交叉偶联等反应。作者在本篇文章中利用基因密码子扩展技术编码在黄色荧光蛋白中的二苯甲酮光催化剂，作为还原光卤化酶（RPDase）可以有效催化各种芳基卤化物的脱卤（氘代）反应，并且适用于各种芳烃卤化物。与依赖金属辅因子的天然脱卤酶不同，RPDase则是利用外源性的甲酸钠为还原牺牲剂，通过光化学产生强还原性二苯甲酮阴离子自由基进行，从而避免对还原性辅酶NADPH的依赖（图1）。作者将黄色荧光蛋白中三肽Gly65-Tyr66-Gly67的Tyr66(酪氨酸)替换为BpA66，形成二苯甲酮-咪唑啉酮发色基团。通过对还原剂、反应介质、催化剂负载量、光波长及强度等方面进行优化发现，对于该反应，RPDase、甲酸钠和光必不可少，空气对该反应不利。缺乏BpA66的天然黄色荧光蛋白无反应性，而编码其他光敏剂的非天然氨基酸，效果较差。 作者得到优化后的反应条件，对RPDase的底物适应性进行了拓展，发现RPDase具有良好的底物适用性。对于吸电子基团或供电子基团取代的芳基溴化物和芳基碘化物，均以良好的收率(49-99%)得到脱卤产物，且缺电子的底物更有利于还原脱卤反应，但芳基氯化物的反应活性较差。作者通过控制实验发现（图2），脱卤还原反应中的氢原子来源于甲酸钠，不受反应介质影响，因此作者以氘代甲酸钠为还原剂，进行了生物催化的脱卤氘代反应。该反应对于含醛基和羰基等还原耐受性较差地底物也能进行，并且以良好的收率和高氘代度成功实现了烟酸及其类似物、氨基烟酸、酪氨酸、倍他米隆甲酯、马尿酸甲酯、沙利度胺和溴芬酸生物活性分子及药物的衍生物的氘代。之后，作者对该人工脱卤酶的催化机制进行了深入研究，通过TEMPO自由基捕获剂、瞬态吸收光谱和电子顺磁共振等实验证明该反应是通过自由基途径进行，作者通过开关灯控制实验发现，该反应在黑暗条件下也能进行，说明该反应存在一定的链传递过程。基于上述实验结果，作者提出了可能的光催化机理，首先基态（S0）的二苯甲酮光敏剂通过光照激发到三重态（T1），甲酸钠对三重态化合物的还原淬灭反应生成了强还原性的二苯甲酮阴离子自由基和二氧化碳阴离子自由基，两者均可促使芳基卤化物单电子还原得到芳基自由基，进一步捕获甲酸钠的氢原子或氘原子得到脱卤（氘代）产物。最后，作者使用表达RPDase的重组大肠杆菌细胞进行全细胞的生物催化，发现RPDase可以同时利用生物体内的NADPH和外源的甲酸钠实现脱卤反应。该研究结果表明，含有人工光催化剂的人工光生物催化有望成为化学原料转化的细胞工厂。总结：
作者通过二苯甲酮非天然光敏剂和黄色荧光蛋白的结合得到了一种通过非自然催化机制的人工光脱卤酶，且能适用于各种芳基卤化物的脱卤反应。使用氘代甲酸钠作为氘源可以精确实现目标化合物的氘代，但氘源价格昂贵，其应用受到较大限制，若该反应能加速从反应介质中捕获氘原子，则可使用廉价的氘源进行脱卤氘代反应，进一步的提升该反应的实用性。最后作者首次进行了表达RPDase的重组大肠杆菌细胞的全细胞生物催化，通过设计合成人工光催化剂，为利用微生物细胞工厂，实现高附加值的非天然化学品的绿色生物制造提供一种可能。Fu, Y., Liu, X., Xia, Y., Guo, X., Guo, J., Zhang, J., ... & Zhong, F. (2023). Whole-cell-catalyzed hydrogenation/deuteration of aryl halides with a genetically repurposed photodehalogenase. Chem. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chempr.2023.03.006
