初始突变体 CalAmDH-M0 对目标底物（如苄基丙酮）的活性较低。通过分子建模发现，活性位点中的大体积氨基酸（如 L40、F76、V134、L296 和 V299）可能阻碍底物的结合。进一步筛选发现，替换 V134 和 V299 为小体积的氨基酸（如丙氨酸）显著提高了活性，分别提升了93倍和42倍。结合 V134A 和 V299A 的突变产生的 M2 突变体对多种底物表现出协同的催化活性增强，主要归因于 kcat 的增加。此外，将亲水性 S300 替换为甘氨酸（M31）进一步提高了活性，并改善了热稳定性和 pH 稳定性，使半衰期在 50 °C 和 pH 10 条件下分别延长至 168 小时和 228 小时（图1）。
M31 在 100 mM 底物浓度下显示出显著的催化活性，相比 M0，对 β-(杂)芳基酮（1s-16s）和 α-(杂)芳基酮（19s-31s）转化率均超过 80%，且光学纯度大于 99% ee。对于体积较大的酮（17s、18s、26s），转化率较低，但 M31 对乙基酮（43s-45s）和醛类（46s-50s）表现出高效的催化活性和优异的对映选择性。M31 对苯基丙胺、抗心律失常药物 mexiletine 等的合成表现出高转化率和良好的光学纯度，证明其对多种底物具有广泛的适用性（方案2）。
尽管 M31 的性能有所提升，但在 500 mM 底物浓度下（1s），转化率仅为 45%。为了实现 M31 的制备应用，作者探索了多种共溶剂来提高反应底物浓度。水溶性共溶剂抑制了 M31 催化的 ARA 反应，而大多数疏水性共溶剂则略微增强了反应。特别地，油酸显著提高了 M31 的活性和稳定性，同时对其他 AmDH 酶（如来自 Bacillus badius、Lysinibacillus fusiformis 和 Jeotgalicoccus aerolatus 的酶）也有类似的促进作用，表明这一方法的广泛适用性（图2）。
研究发现油酸对 M31 的催化性能和稳定性有显著提升作用。分子动力学模拟显示，油酸通过与 M31 上的 α5 区域强烈的疏水性相互作用和盐桥作用，稳定了酶的构象，阻止了 α5 区域的螺旋-环转变，进而提高了催化效率。此外，油酸还能形成胶束，有助于底物溶解和质量传递，进一步增强了反应效果。实验验证表明，油酸不仅增强了酶-底物的相互作用，还提高了酶的热稳定性和溶剂抗性。基于这一发现，通过优化反应条件，使用 M31 进行 (R)-4-苯基丁胺的半制备合成，获得了 95% 的产率和 >99% 的对映纯度，并在大规模反应中成功制得 1.01 kg 的产物，符合 GMP 标准（图3）。
为了克服某些酮类底物的不稳定性、昂贵性或难以获得的问题，作者利用了更具成本效益和易得的酮类前体（如烯烃、炔烃或醇类）来进行合成。开发了三种化学酶联级联反应，结合了 M31 和 Pd 催化的 Heck 反应（用于烯烃醇的反应）、Hypoiodite 催化的反式-马克-阿夫尼科夫氧化反应以及 Au 催化的炔烃水合作用。在 Heck-ARA 级联反应中，先进行 Heck 反应（在 100°C 下进行，不使用生物催化剂），然后回收异相催化剂，再加入生物催化剂进行 ARA 反应（37°C）。这一一锅法级联反应成功合成了用于高血压药物 Dilevalol 和 Medroxalol 的手性前体。后续级联反应中，由于化学催化剂与油酸的不兼容性，油酸需要在化学反应完成后再加入，并与生物催化剂一起回收。氧化-ARA 级联反应成功地不对称合成了安非他命和 formoterol 的前体；水合作用-ARA 级联反应则生产了 mexiletine、heptan-2-amine、tuamine 和 1,3-dimethylbutylamine。所有这些反应在克级规模上进行，总体产率超过 80%，对映纯度大于 99.9%，展现了其在制药相关胺类合成中的实际应用潜力（方案3）。
总之，通过分子对接和动态模拟提升耐热性 AmDH 活性，已经成为成功的催化剂工程策略，不仅提高了催化活性，还增强了催化稳定性。本研究强调了酶中常被忽视的环区在催化中的重要性。经过工程化改造的 AmDH 突变体在产物收率和催化效率上的表现，显示了其在商品化和大宗化学品合成中的潜在应用。展示了将生物催化不对称还原胺化（ARA）从制药领域拓展到更广泛工业领域的途径。尽管目前生物催化反应主要局限于制药行业，原因在于酶在生产大规模、低成本产品方面的效率不足，而制药行业的生产规模有限，限制了生物催化在提升环境可持续性方面的潜力。这一研究为突破这一局限提供了重要的见解，推动生物催化成为化学工业的变革性技术。
文章信息：Activation and Stabilization of Engineered Amine Dehydrogenase by Fatty Acids for Bioprocess Intensification of Asymmetric Reductive Amination
文章链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c05904
