ImageJ | 荧光强度测量

文摘   科学   2024-07-06 11:35   上海  

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免疫荧光

免疫荧光染色是研究特异蛋白抗原在细胞内分布的一种常用实验技术,通过荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下对抗原进行细胞定位。
免疫荧光的照片不仅仅可以做形态学分析,还能通过检测荧光强度,对在特定位置表达的信号进行半定量分析。

▲免疫荧光染色原理
(来源:https://en.wikipedia.org/wiki/Immunofluorescence)

今天小编就给大家分享如何通过 ImageJ 进行荧光强度的测量,喜欢的小伙伴们记得 点赞、收藏+分享 哦~

具体的操作流程如下:

1
选择合适的成像条件



选择正确、合适的成像条件,是进行荧光强度分析的重要一环,它关系到我们能否观察到真实的荧光强度变化。

小编之前的文章专门提到了成像的一些注意事项,详情速戳:


对于测量荧光强度来说,成像时需要注意以下几个方面:

1、选择更大的位深度(Bit-depth),如果相机支持10-bit、12-bit或16-bit,尽量选择位深度大的成像模式;

2、选择合适的曝光时间以及激光功率,避免过曝和欠曝;

3、如果需要组间对比,需要保持组间的成像条件一致;

4、图像导出时避免有损压缩。


2
确定具体测量参数



在测量荧光强度之前,首先要搞清楚:我们想通过荧光强度这个参数,来回答什么问题。

荧光强度在ImageJ中可以有两种形式:

1、平均荧光强度(Mean gray value)

2、累积荧光强度(Integrated density)

对于一张单通道的荧光图片,每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小,特定区域的荧光强度公式:

平均荧光强度(Mean) = 该区域荧光强度总和(IntDen) / 该区域面积(Area)

Mean: Mean gray value
IntDen: Integrated Density

例如,我们想要比较细胞内的颗粒状信号,测量蛋白X表达有多么地集中,那我们需要选中这些颗粒,测量平均荧光强度(Mean Gray Value)。

如果我们想要比较同一个细胞内总的蛋白表达含量,随着时间的变化情况。可以选中整个细胞,来测量累积荧光强度(Integrated Density)。



3
选择蛋白表达的位置和测量



测量荧光强度的原则是:蛋白在哪里表达,就选择哪里进行Measure

所以在测量荧光强度时,最关键的一步就是选中信号所在的位置,尽量不选中背景。

下面以 ImageJ 自带的Sample为例,介绍一下怎么进行荧光强度的检测,大家一起跟着小编做起来吧~

(File -> Open Samples -> HeLa Cells(48-bit RGB)):



1、加开图像后,提取出单一通道

(Image->Color-Split Channels)

如果图像储存时为RGB格式或者Composite形式,需要先分割出该通道:



如果图像是8bit, 16-bit, 32-bit,这个图像就已经是单通道的图像了,可以直接进行后续操作。

注意:如果图像已经是16-bit,或32-bit,就不要转成8-bit,因为更大的位深度能包含的pixel value的范围更大,编码了更多的信息,如果转成8bit,就损失了信息。

2、选中目标蛋白表达的位置

这里分两种情况:
  • 蛋白在整个细胞质都有表达
  • 蛋白仅在细胞内的颗粒中进行表达

(1)对于第一种情况,我们需要直接选中细胞所在的区域,可以利用Freehand selections tool手动选中细胞:




当然这种细胞也可以利用Cellpose,进行自动分割,在以后的文章中会进行介绍。

在Analyze -> Set Measurements中勾选Mean gray value和Integrated Density:



然后Analyze -> Measure即可得到Mean gray value和Integrated Density:



这里注意IntDen和RawIntDen的区别:
IntDen = Mean * Area(校准比例尺,换算后的面积,单位μm^2)
RawIntDen = Mean * Area(未校准比例尺的面积,单位Pixel)


(2)对于第二种情况,我们需要选中细胞内的颗粒,如果一个个手动圈选就太繁琐了,我们可以利用设定阈值(Threshold)的方法,选中这些颗粒。

关于阈值的具体介绍,可以参考之前的公众号文章:



1) 调整阈值,选择适当的区域

(Image->Adjust->Threshold)

设定Threshold的原则是:尽可能多地选中信号,不选中背景。



注意:
  • 建议用Red来表征选中区域;

  • 荧光图片的背景通常是黑的,所以需要勾选Dark Background;

  • 调整好Threshold后不用点击Apply、Set等按键,红色部分其实已经选中了。

这里需要注意,Threshold选中的是整张图片的颗粒,如果我们要测单个细胞的话,可以先选中我们要测量的那个细胞,再进行Threshold:


这样就只会测量选中细胞内,Threshold选中的区域。

2)Analyze -> Set Measurements

勾选Limit to threshold(十分重要),如果没有勾选Limit to threshold,则测量的是整张图片的平均荧光强度,而不是Threshold选中的区域。



3)检测(Analyze->Measure)

点击Measure后弹出检测结果:



这样我们就得出了图片的平均荧光强度,但需要注意的是:免疫荧光是半定量分析,平均荧光强度只能半定量地表征特异性蛋白的表达


4
减去背景




因为制样等因素,我们在对不同样品进行成像的时候,即使成像条件完全一致,图像的背景可能会有差别。这部分的背景信号需要在最后的结果中减去。

测量背景的原理与测量荧光强度的一致,我们可以利用矩形工具在图像上框选出一片没有信号的区域进行测量,从而Measure得到背景信号:


最终的平均荧光强度应该减去这个平均的背景信号。


总结



想要准确地测量荧光强度,不仅要选择合适的成像条件,在图像处理时,也要注意测量位置的选取以及背景的校正。





好了,今天的分享就到这里了,下期我们将给大家分享关于【比例尺的矫正和添加】,敬请期待哦~~

小伙伴们如果对于 ImageJ 使用有疑问,可以私信我哦~
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更多教程可以关注我在知乎上的专栏:Treasure琛
希望对大家有帮助~ 

作者 | Treasure琛

校稿 | 小乐喵喵   

排版 | 小乐喵喵  


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