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最近有很多同学都提到一个相同的问题：对于免疫荧光双标记的细胞，怎样能对共标的细胞进行计数？
注意
这里说的共标不是像下面这类，对细胞内的荧光点进行计数，后面会专门出一期教程。
这篇文章就介绍一下，怎么利用 ImageJ 对共标的细胞进行自动计数，这种方法同样可以作为一种简单的共定位分析。
这里以下图的脑片染色为例：
对于 共标特别明细 的细胞，我们可以直接利用 Image -> Adjust -> Color Threshold 进行共标细胞进行分割。
在这个例子中，即 通过 Color Threshold 圈选出黄色的细胞。例如下图：白色部分即为框选部分。
但如果 背景干扰较大，且部分 红色、绿色通道的细胞亮度差异较大，就不能用 Color Threshold 很好地框选出共标细胞。
所以需要采用另一种统计逻辑：
通过 分别统计两个通道的细胞，得到两个通道细胞的 ROI（Region of Interest），然后计算两个通道ROI的 重叠部分（Overlap），再进行细胞计数。
01
利用机器学习的方法分割细胞
首先通过 Image -> Color -> Split Channels 分别提取两个通道，参考这篇文章：
▲ 点击图片跳转原文
《ImageJ 基础篇 | 荧光图像的合并与分割》
分割后红绿两个 channel：
利用基于机器学习的细胞分割-Trainable Weka Segmentation，进行细胞分割：
《ImageJ | 基于机器学习的自动细胞分割》
或者 Cellpose 进行细胞分割：
▲ 点击图片跳转原文
《Cellpose | 细胞分割神器》
这篇文章以 Trainable Weka Segmentation 这个插件为例，Create Result后，得到分割结果：
02
得到重叠部分的ROI
把分割得到的结果，通过 Threshold 选中后 Apply，得到二值化的图像：
然后创建选取区（Edit -> Selection -> Create Selection）
将选取区添加到 ROI Manager（Analyze -> Tools -> ROI Manager）当中，分别重命名为 Red 和 Green：
然后选中两个 ROI，在 More 里面选择 AND 操作，即可得到重叠部分：
将重叠部分 Add 到 ROI Manager 中，重命名为 Double Label：
03
对重叠部分进行自动细胞计数
放大之后，可见 重叠部分有很多假阳性的杂点：
将 Selection 转为Mask，得到二值化图片（Edit -> Selection ->
Create Mask）
▲ 共标的细胞Mask
之后的操作和自动细胞计数的流程一样，参考这篇文章：
▲ 点击图片跳转原文
《ImageJ 基础篇 | 基于阈值分割的自动细胞计数》
先框选一个细胞，Measure 得到细胞大小，例如在这里一个细胞的 Area 大概为 207 左右：
将细胞尺寸的下限定为 150，以去除假阳性的杂点：
Analyze Particles 之后，即可得到双标细胞总数为 41 个。通过ROI Manager 检查最终结果的准确性：
注意
单通道细胞分割的准确性，直接影响双标细胞的计数结果。建议单通道细胞分割要尽量准确，尽量减少假阳性。
END
往期回顾
◆ 荧光强度测量
