科 / 研 / 图 / 像 / 处 / 理
在描述不同情况下，细胞之间的荧光强度变化时，通常会将两者作一个比值，得到荧光比率图，从而可以直观地观察到空间上的变化情况：
这篇文章会讲解 怎样利用ImageJ做荧光比率图。
以 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 图像为例，通过 将FRET 图像 (YFP) 与 Donor 图像 (CFP) 作比值，可以观察蛋白之间相互作用的位置：
一、去除背景
首先去除目标信号以外的背景，这一步本质是将细胞与背景分割开来。
1、利用运用Threshold选中细胞（Image -> Adjust -> Threshold）
2、得到选取区（Edit -> Selection -> Create Selection）
并且将该选取区 Add 到 ROI Manager 当中
3、清除选取区之外的信号（Edit -> Clear Outside）
在两个 channel 的原图上选中该 ROI，然后清除选取区之外的信号，即背景：
二、计算比值
利用Image Calculator计算两张图的比值（Process -> Image Calculator）：
▲注意勾选32-bit(float) result
从而得到比率图：
三、添加伪彩与 Calibration Bar
关于伪彩与 Calibration Bar 的详细介绍，参考这篇文章：《》
▲ 点击图片跳转原文
1、添加伪彩（Image -> Lookup Tables -> Spectrum）
这里添加 Spectrum 样式的伪彩，可以适当调节对比度（Image -> Adjust -> Brightness/Contrast）
2、生成 Calibration bar（Analyze -> Tools -> Calibration Bar）
这里 Calibration bar 可以不直接添加到图像上，可以单独生成，然后在 Figure 排版时添加：
3、将比率图转为 RGB 格式（Image -> Type -> RGB color）
转为RGB后，如果背景想要是黑色，可以重复（Edit -> Clear Outside）去掉背景这一步骤，这里需要注意后景色需要是黑色：
最后得到：
通过该图像配合 Calibration Bar，即可对蛋白相互作用的区域进行定位。
往期回顾
◆ 荧光强度测量
