ImageJ | 科研人必备，Western Blot 条带定量分析正确方法
文摘
科学
2024-07-10 09:59
上海
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对 Western Blot 等条带进行定量分析，是 ImageJ 最为广泛的一种应用。全网的教程五花八门，步骤流程往往也各不相同。有些教程缺乏基本的原理解释，导致看了教程只会操作，而不知道其中的原理。而且有些教程的部分操作有误，而且不适合所有情况。这个问题在过去被很多人忽视，是因为在条带本身质量和对比度很好的情况下，即使 ImageJ 操作过程有问题，最后也会得到相对正确的趋势。但如果条带之间的变化比较小，就需要在成像和 ImageJ 分析过程中采用较为严谨的方法。这篇文章是为了解决这一问题，不仅仅从结果，也从原理出发，系统介绍Western Blot 条带定量分析的正确流程。写在中间：
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之前我在知乎上发布的教程（同步更新）：
ImageJ实用教程：
https://www.zhihu.com/column/c_1069243926476673024
ImageJ开发教程：
https://www.zhihu.com/column/c_1101076075773370368
MATLAB科研图像处理：
https://www.zhihu.com/column/c_1280465791246987264
Python科研图像处理：
https://www.zhihu.com/column/c_1640647301939822592
没有好的成像结果，往往就得不到好的分析结果，成像注意事项可以参考之前的这篇文章：在进行 Western Blot 定量时，我们往往会过多关注分析阶段，而忘记了同样重要的上样和成像阶段。在这里，最需要注意的两个因素：上样量以及曝光问题。在做 Western Blot 定量时，我们的基本假设是 样品浓度和条带之间是线性关系 [1] ：但这个线性关系是需要进行验证的。在实验室操作中我们一般会加固定量的蛋白，而不确定最佳蛋白上样量，因此成像时导致条带饱和的可能性很大 [2] ：
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- 从上图可以看出，当 Protein load 大于 4μg 后，蛋白质浓度和条带强度之间的线性关系就不太好了；
- 浓度高于 5μg 后，条带已经饱和，更高的蛋白浓度已经无法通过条带进行定量了。
所以在进行 Western Blot 定量之前，我们最好先探究这一线性范围。用已知浓度的蛋白进行梯度稀释，生成这一的标准曲线，从而确定合适的上样量范围。成像时，我们需要确保弱的条带也能看到的情况下，信号强的条带不过多地过曝饱和，所以需要确定合适的曝光时间。不同的曝光时间会导致图像有不同的动态范围（Dynamic Range）[3] ：![]()
从上图可以看到，随着曝光时间的增长，虽然弱的孔渐渐显现出来，但信号强的孔会越来越饱和，从而丢失了信息，而且长曝光会增加背景噪声。在实际成像时，建议存储曝光时间，由低到高，不同曝光时间的图像。选取中间动态范围最高的一张进行分析，如图中曝光时间在 0.8 s 时，可以检测到最大的对比范围。条带分析有两种方法，一是利用 ImageJ/Fiji 自带有 Gels 工具，二是通过框选直接 Measure 测量。如果操作正确，这两种方法得到的条带趋势是一致的。但两种操作有各自需要注意的地方，如果操作有误，就会测出不同的结果。这里以 ImageJ 自带的 Gels 图像为例，分别介绍两种方法对条带进行定量：![]()
两种方法的 第一步都是背景校正（当然，如果你存图像的时候，存的是RGB格式，需要Image -> Type -> 8-bit，先把图像转成8-bit）。做背景校正是为了减少背景不均，对结果造成的影响。例如下面这种图：![]()
在空白地方画一个框，Analyze -> Plot Profile，可以看出背景的变化，这种不均匀的背景会导致结果的偏移：
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背景校正，通常采用 Process -> Subtract Background，用 Rolling ball 算法 [4] 。这个算法的本质是提取出图片中均匀变化的背景，将这个背景减去原图:![]()
在做 Subtract Background 时，需要注意的点是合理地选取 Rolling ball radius：
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大部分教程以及官网给的 example，都默认 Rolling ball radius 是50 pixels，这是不合理的。Radius 值需要根据图像的具体情况设置。图像分辨率不同，背景不同，Radius 值也需要随之改变。设置 Rolling ball radius 的原则是：只留下图像的背景，而看不到条带的信息 [5] 。在设置时，可以先勾选 Create background (don't subtract) 以及 preview。观察提取的背景，是否符合这一原则：![]()
如果 radius 合适，再取消勾选 Create background (don't subtract)，点击 OK，得到减去背景后的图像：![]()
背景校正后，就可以利用 Gels 工具或者直接框选进行 Measure。![]()
2、将这一行条带设置为第一道（Analyze -> Gels - Select First Lane）/（Ctrl + 1）![]()
出现这个警告，是因为图片的尺寸是 276(宽)×467(高)，高大于宽，所以Gels 工具会认为你应该画一个高大于宽的，竖着的矩形，纵向对比条带。这里有个小妙招，可以通过 Image -> Adjust -> Canvas Size，把宽的长度增大，从而避免出现只能横向移动条带的问题。3、画出这一道条带，在横线上的profile（Analyze -> Gels -> Plot Lanes）/（Ctrl + 3）![]()
这里需要 重点解释一下为什么会画出来这样的profile，这也是大多数教程忽略的一点。这里 Plot Lanes，横坐标是刚才框选的这一道条带的长，纵坐标是矩形纵向（宽）的 pixel value 的和：![]()
这个原理和 Analyze - Plot Profile 是一样的，只不过 Gels 工具自动把图像做了一个反转。如果我们把整张图 Edit - Invert，框选中一个条带，进行 Analyze - Plot Profile，也可以看到这样的peak：![]()
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为什么我们需要对每一峰进行封口？换句话说，为什么这些峰的波谷区域不是0？背后的原因其实是因为这两个条带离得太近了，信号在交界处汇集在了一起：![]()
信号强的条带普遍会更粗，面积更广。所以一个条带的信号在边缘还没有衰减完全，就接上了相邻条带的信号。![]()
所以如果遇到这种需要封口的情况，我建议利用垂直封口的方法。虽然这种方法会稍微损失一点信号（如下图，蓝色区域），但是和整体信号相比是较少的（红色区域）：
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波峰封口的方法是错误的，这种封口方法，认为蓝色区域都是背景，但做完背景校正后，根据 Plot Profile，这一部分区域，其实还是条带本身的强度：
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这里的Area，可以理解为这一个条带 pixel value 的总和/积分。另一种更简单的方法，是利用矩形工具框选条带进行测量。第一步还是背景校正，如上文所述。
一般的条带图像，条带是黑的（pixel value 低），越黑代表信号越强。反转后，条带是白的，越亮信号越强。![]()
如果框选的时候看不清，可以 Image - Adjust - Brightness/Contrast。只要调节对比度后不点击 Apply，就不会更改原始图像的 pixel value。2、设置测量参数（Analyze -> Set Measurements）![]()
这里需要勾选 Integrated density。3、依次测量每个条带（Analyze -> Measure）![]()
这里需要注意，直接框选的原则是：尽量选中所有信号，少选中其他条带或者背景。这里我没有更改矩形框的大小，有些教程会根据条带的宽度或者长度，更改矩形框的大小，但只要符合框选的原则，结果不会有显著差别。2、整体旋转图像（Image -> Transform -> Rotate），将图像旋转水平/竖直；先用Segmented Line，将条带从左向右连接起来。双击后，设置合适的厚度：![]()
Edit -> Selection -> Straighten:![]()
今天的分享就到这里了，希望对你有帮助！
2、采多个曝光时间的图像，选择Dynamic range最高的图像进行分析；3、Subtract background 需要根据图像，选取合适的rolling ball radius;5、上样的时候用间距更大的梳子，避免相邻两个条带之间的信号出现交集。1. Pillai-Kastoori, L., Schutz-Geschwender, A. R., & Harford, J. A. (2020). A systematic approach to Quantitative Western blot analysis. Analytical Biochemistry, 593, 113608. 2. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., & Hammond, M. (2013). A defined methodology for reliable quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology, 55(3), 217-226. 3. Film and CCD Imaging of Western Blots: Exposure time, signal saturation, and linear dynamic range https://www.licor.com/documents/x7ncrrtjt4t1jqdbp0ai4. Sternberg, "Biomedical Image Processing," in Computer, vol. 16, no. 1, pp. 22-34, Jan. 1983.5. Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., & Dotor, J. (2018). A new background subtraction method for western blot densitometry band quantification through Image Analysis Software. Journal of Immunological Methods, 457, 1-5.
