成像注意事项
第一篇文章里我曾经写过：没有不好的数据，只有不好的分析。因为即使是一些质量不好的数据，如果积极挖掘数据里的信息，还是能得到一些有用的结论。
但实际的科研过程中：如果没有好的数据，就不可能做很好的分析。图像质量的对于好的实验结果至关重要。
图像处理其实不仅仅局限在采完数据之后，其实应该在制样和成像时就要开始关注，后续图像处理的问题。
常常会有一些同学，把所有图像数据都收集完了，开始图像分析的时候才发现，因为成像或者制样的问题，自己采的图像很难分析。
有的甚至从一开始就拍错了，数据回答不了自己想回答的问题。这是非常痛心疾首的。
这一篇会讲一讲成像这一步需要注意的问题，一些错误大家在成像的时候可以尽量避免。因为只有拍到高质量的图像，才能方便后续的图像分析。
关于成像的基本原则可以看官网的这篇介绍：https://imagej.net/imaging/principles
成像大致可以分为三种
1. 明场成像
例如拍摄的自然图像、明场的细胞图像、免疫组化等；
2. 荧光成像
例如共聚焦、双光子成像等；
3. 非传统光学成像
例如CT、MRI、电镜等。
一
图像格式
1、避免有损压缩
成像后保存图像、传输图像以及处理图像，要确保为无损压缩格式，例如TIF。不要保存为JPG等有损压缩格式。
参考论文：
Peter Bankhead, Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ, (2014)
这是最容易犯的一个错误，不论是哪种成像方式，都应该尽量确保图像质量。
JPG格式的图像肉眼可能看上去“清晰”，但是放大之后就会看到很多方格状的假象(Artifact)，这会对图像处理以及定量造成影响。
我们可以在LAB颜色模式下，明显观察到图像有损压缩有的变化：
RGB格式每个通道只能包含8-bit的强度范围，所以如果你的图像是16-bit的单通道荧光图像，不要把图像存储成RGB格式。
8-bit单通道荧光图像可以存储成RGB格式，但是没有必要，因为一般处理的时候还是要转成8-bit，且RGB格式更占空间。
3、避免比例尺覆盖信息
另外，需要强调：存图片的时候，不要把比例尺也印在上面！！！
比如这样：
完全可以用一张已经加过比例尺，且同样放大率的图片来进行比例尺校准。
除了信号外，图像上任何多余的信息都会对图像处理带来麻烦。有些比例尺甚至会覆盖原图的信号。
比例尺的本质其实就是图像的一个pixel对应了实际多少长度，如果成像条件一致，只需要记住这个对应关系即可，不需要把比例尺印在图像上面。
二
成像条件
成像时候需要考虑很多成像参数，例如：激光功率/光照、曝光时间、增益（Gain）、补偿（Offset）、白平衡等。以及基本参数：放大倍数、位深度、Binning等等。
不同的情景对于成像参数的要求是不同的，不能仅仅是看得觉得清晰，需要根据具体想要分析什么，做对应的调整。
1、定量分析
如果要进行定量分析，例如对平均荧光强度进行定量，一定要保证组间的成像条件是完全一致的。否则一个组激光功率高一点，另一个组低一点，会造成人为的“差异”，这是需要避免的。
而且定量分析需要避免过曝的情况，对于8-bit的图像，像素值在255就饱和了，图像大范围都过曝，会丢失亮度分布的信息：
2、图像分割
如果仅仅是需要对图像进行分割，成像时需要：
① 物体的轮廓清晰；
② 物体和背景有较好的对比度；
③ 物体间的overlap尽量少。
这三项都需要好的制样，让样本的信号尽量强，背景尽量小，而且信号不能太密。
三
通用原则
这里列一些比较通用的细节：
1、注意荧光漂白(Bleaching)的效应以及激光的光毒性(Phototoxicity)，在拍3D stack的时候会出现这个问题，但一定程度是可以校准的，后面会讲到。
2、明场成像，需要注意白平衡。
3、光照不均匀导致背景不均匀，除了通过调整光源，也可以通过减背景的方式校正。
4、根据情况选择放大倍数、成像范围。如果不需要看细节，可以缩小放大倍数，换取更大的成像范围。根据想要回答的问题，选择最合适的基本参数。
总结：图像采集和图像分析是相辅相成的，并不是简单的先后关系。不要等图像采集完了再开始分析。在采到初步结果后，就应该尝试去建立图像处理流程，并通过遇到的问题，优化图像采集。
读者朋友们遇到图像处理问题可以私信我哦~
更多教程可以关注我在知乎上的专栏：Treasure琛
希望对大家有帮助~
