Molecular Neurodegeneration：小胶质细胞的区域异质性与阿尔茨海默病的认知能力有关

导读

小胶质细胞激活是阿尔茨海默病（AD）神经病理学的一个标志，但大脑中小胶质细胞区域相互作用的影响尚不清楚。近期，《Molecular Neurodegeneration》在线发表了题为“Regional desynchronization of microglial activity is associated with cognitive decline in Alzheimer’s disease”的研究论文，作者团队评估了功能失调的小胶质细胞和AD病理生理对小鼠大脑中转运蛋白(TSPO)-PET的区域间相关系数（ICCs）的影响，并将个性化的小胶质细胞不同步指数与认知表现联系起来。该研究发现AD小鼠模型的小胶质细胞同步性显著降低，且AD连续体表现出与认知能力下降相关的小胶质细胞同步性降低。研究结果表明小胶质细胞同步性与AD的认知能力下降密切相关，可作为疾病进展的独立个性化生物标志物。

结果1.小胶质细胞耗竭证明了通过TSPO-PET评估小胶质细胞同步性的概念

由于PET信号是特异性结合（不限于小胶质细胞）、脱靶结合和非特异性结合的复合体，作者首先测试了TSPO-PET的ICC是否可以检测到小胶质细胞特异性同步性。为此，作者将具有药物小胶质细胞耗竭 （WT PLX5622） 的 WT 小鼠与具有完整小胶质细胞的WT小鼠（WT安慰剂）进行了比较（图2A）。 药物耗竭导致小鼠大脑中Iba1阳性细胞在治疗7周后减少>99%。与WT安慰剂相比，WT PLX5622组中[18^F]GE-180摄取（SUV）显著降低（补充图S1）；然而，由于其他细胞类型如内皮和室管膜、非特异性结合和游离示踪剂的存在，尽管小胶质细胞几乎完全耗尽，但它不是零。具有完整小胶质细胞的WT小鼠的ICC绝对中位数为0.642(0.353,0.912)（图3A和B），共有76个显著连接，包括7个皮质连接，23个皮质下连接和25个皮质-皮质下连接（图3C）。耗竭的WT 小鼠显示ICC绝对中位数显著降低（0.325（0.154，0.547），p < 10^-15）（图3A和B），显著连接明显减少（总共15个，皮质2个，皮质下3个，皮质-皮层下4个连接;图3C）。作为验证，作者使用心肌调整后的标准化摄取值（SUV）作为另一种归一化方法重复分析，发现结果高度一致（补充图S2）。因此，TSPOPET数据表明，在健康的哺乳动物大脑中存在特定的小胶质细胞连接组。

图2. 每个研究队列的平均TSPO-PET摄取量

结果2. 在功能失调的小胶质细胞存在的情况下，小胶质细胞的同步性降低

接下来，作者进行小胶质细胞与存在但功能失调的小胶质细胞的同步性评估（图2D和E）。作者使用Trem2缺失的小鼠，发现WT和 APPPS1转基因模型中显著连接数量明显减少。对于WT小鼠（图3D-F），Trem2缺陷使连接总数从44个减少至17个，其中皮层-皮层下连接受影响最大(从17个减少到1个；图3 F)。ICC绝对中位数从0.418（0.165,0.681）下降到0.319 (0.152,0.478) (p< 10^-3；图3E)。对于Trem2缺失的APPPS1转基因小鼠（图3G-I），可观察到与完整的Trem2相比，连接总数从23个减少到10个。在Trem2^−/−队列中，与Trem2^+/+相比，皮质和皮质-皮质下连接几乎不存在（分别为6对1和11对1），而皮质下连接的数量保持相似（6对5）（图3I）。在APPPS1转基因模型中，ICC绝对中位数不受Trem2缺乏的影响（0.412（0.176,0.702）对0.420 (0.208,0.666), p=0.72）（图3H）。这些数据表明功能失调的小胶质细胞导致小胶质细胞同步性降低，作者在APPPS1小鼠中的观察提出了一个问题，即小胶质细胞同步性是否在Aβ存在下已经降低，而不会因Trem2功能丧失而进一步降低。

图3. 通过区域间相关系数 （ICC） 评估小胶质细胞同步性的特异性

结果3. AD神经病理学降低小胶质细胞同步性  

因此，作者测试了是否可以在阿尔茨海默病小鼠模型的病程早期检测到小胶质细胞同步性的改变（图2F）。与年龄匹配的WT小鼠相比，在2个月和5 - 6个月大的AD小鼠模型中，观察到ICC绝对中位数和连接数量的显著下降。

早期的队列(2.0-2.5个月),P301S小鼠的ICC绝对中位数从0.542(0.294,0.873)降至0.360 (0.163,0.636) (p < 10^-6) (图4 A和B)，App^NL-G-F小鼠的ICC绝对中位数降至0.384 (0.167,0.666)(p <10^-5)(图4 B和C)。在两种疾病模型中，连接总数也相当小（WT、P301S、App^NL−G−F分别为35、17、19），这是由于皮质和皮质-皮质下连接减少(皮质：6、1、5；皮层-皮层下：16,3,2；皮层下：WT、P301S、App^NL−G−F分别为7、8、7个)（图4D和E）。

图4. 神经病理学发作时AD小鼠模型小胶质细胞同步性的评估

在5至6个月大时（图5），ICC绝对中位数从WT的0.507（0.222,0.856）下降到P301S小鼠的0.410 (0.173,0.676)(p< 10-5)（图5A和B）， App^{NL - G - F}小鼠的0.352 (0.126,0.617)(p< 10-6)（图5B和C），APPPS1转基因小鼠的0.333 (0.184,0.562)(p< 10-7)（图5B和D）。连接总数的减少（P301S、App^NL−G−f小鼠和APPPS1转基因小鼠分别从60个减少到38个、23个和18个）主要与皮质下连接和皮质-皮质下连接的丧失有关(皮质下：14、4、5、3；皮层-皮层下：25,16,6,3；在P301S，App^NL−G−F小鼠，APPPS1转基因小鼠中，分别为11,12,10,7)（图5E-G）。综上所述，小胶质细胞的同步性在神经病理变化的早期阶段就已经下降，而传统的TSPOPET读取对检测小胶质细胞的激活不敏感。

图5. 中度神经病理学AD小鼠模型中小胶质细胞同步性的评估

结果4.AD小鼠模型中的小胶质细胞缺失加剧了不同步

为了证明AD小鼠模型中剩余的TSPO-PET同步性也归因于小胶质细胞，作者在AD小鼠中使用PLX5622进行小胶质细胞耗竭，并将其与具有完整小胶质细胞（安慰剂治疗）的AD小鼠进行比较。作者测试了两种Aβ小鼠模型：APPswe/PS2 （PS2APP）和APPswe/PS1 deltaE9 (deltaE9)（图6）。通过免疫组化分析PS2APP小鼠的大脑，在治疗七周后，Iba1阳性细胞减少了66%。与WT小鼠类似，观察到ICC绝对中位数和连接数量都有所减少；然而，正如不完全耗竭所预期的那样，效果弱于WT小鼠。

在、PS2APP队列中，安慰剂治疗后小鼠的ICC绝对中位数从0.415（0.225,0.735）降至PLX5622治疗后小鼠的0.294 (0.129,0.541)(p< 10^-4)（图6A和B），连接总数从13个降至3个(皮质：从3个降至1个；皮层下：从2到1；皮层-皮层下：从2到0)（图6C）。在deltaE9队列中，PLX5622治疗动物的ICC绝对中位数降低更为显著：从0.937（0.550,1.405）降至0.410(0.175,0.767)（图6D和E）。deltaE9小鼠连接数量的大幅下降归因于皮质下连接和皮质-皮质下连接的缺失(皮质：5,8；皮层下：13,1；皮质-皮质下：安慰剂组和PLX5622组小鼠分别为10，1)（图6F）。

图6. 小胶质细胞耗竭后Aβ小鼠模型中小胶质细胞同步性的评估

结果5.小鼠队列显示小胶质细胞同步性降低，皮层-皮层下连接受到的影响最大

由于确切的连接数取决于队列中受试对象的数量和各种批次效应，因此作者对结果进行了标准化，以便在不同实验的队列之间进行比较。为此，作者将每个队列的连接数除以相应参考队列的连接数，得出所有连接的连接数比率（图7）、皮质连接（补充图S3A）、皮质-皮质下连接（补充图S3B）和皮质下连接（补充图S3C）。然而，在与非等效参考队列进行比较时需要谨慎（非WT参考队列用于APPPS1 Trem2^−/−，deltaE9 PLX5622和PS2APP PLX5622）。在大多数队列中，连接数比率的最显著降低发生在皮层和皮层下（补充图S3B）。值得注意的是，小胶质细胞缺失的WT队列（WT PLX5622）显示出最低的总连接数比率，揭示了观察到的去同步的小胶质特异性。同样，deltaE9 PLX5622和PS2APP PLX5622队列显示总连接数减少；然而，不如WT PLX5622低，可能是由于神经病理学导致的参考队列（分别为deltaE9安慰剂和PS2APP安慰剂）的不完全消耗和已经降低的同步性。所有三个PLX5622组均表现出皮质-皮质下网络（补充S3B）和皮质下网络（补充图S3C）连接数量的显著减少，WT PLX5622和PS2APP PLX5622也表现出皮质网络的减少。相比发病时和中度发病时的AD小鼠模型，发现较年轻的Aβ小鼠模型（App^NL−G−F 2.5 M）的总连接数比（0.54）高于较老的模型（App^NL−G−F 5 M和APPPS1 6 M）；0.38和0.30)（图7）。相比之下，tau模型（P301S）在2 M时从0.49增加到6 M时的0.63（图7）。尽管如此，所有AD小鼠模型在中度神经病理下的皮质下连接数比与发病时相比减少了三到四倍（补充图S3C）。

与各自的参考队列（Trem2^+/+和APPPS1 Trem2^+/+）相比，Trem2^−/−和APPPS1 Trem2^−/−的连接总数减少了50%以上（图7）。在APPPS1转基因小鼠中，Trem2缺乏对皮质小胶质细胞同步性的影响更为明显（补充图S3A， Trem2^−/−的皮质连接数比0.17比0.55）。在两种模型中，对皮层下连接和皮层与皮层下连接的影响相似。

图7. 所研究的小鼠队列中连接总数相对于其相应参考队列的比率

结果6.将小胶质细胞的同步性评估应用于人类TSPO-PET得到与临床前研究相似的结果

作者将同样的方法应用于TSPO-PET ICCs的人体数据，包括健康对照和AD连续体患者（补充表S2），与临床前研究相比，得到了相似的结果。为了使每个队列的受试者数量相等，从而具有可比性，健康对照队列（CTRL）由17名受试者组成：13名CTRL（训练）和4名CTRL（测试）。与前驱期AD和AD痴呆患者相比，CTRL队列的ICC绝对中位数显著升高(0.276（0.133,0.466）对0.256 (0.124,0.436)；p_{CTRL-prodromal}< 10^-4)和0.266 (0.129,0.451)；p_CTRL-ADD =0.03)，图8A-C)。

与AD痴呆组相比，前驱期AD组的ICC绝对中位数略低（p=0.03，图8B）。重要连接的总数呈阶段依赖性减少（CTRL: 236，AD前驱期：194，AD痴呆：170，图8D F）。在AD前驱期和AD痴呆中，顶叶连接的数量从CTRL组的128个下降到100个。顶叶-颞叶连接数从对照组的70个减少到AD前驱期的66个和AD痴呆期的52个。颞叶连接减少最为显著（CTRL:38， AD前驱：28，AD痴呆：18）（图8G和H）。

图8. 评估 AD 连续体和健康对照患者的小胶质细胞同步性

结果7.AD特征区域的个性化小胶质细胞去同步指数显示AD连续体的阶段依赖性进展及其与认知表现的关联

接下来，作者在AD连续体的对照组和患者中开发了一个个体区域小胶质细胞激活不同步的指数（图9A）。这能够证明个体不同步指数随着AD连续体的阶段而增加。在6个顶叶VOIs（Schaefer 72、178、99、199、63、53，图9B）和4个颞叶VOIs（Schaefer 58、153、163、15，图9C）中，观察到CTRL、前驱AD和AD痴呆之间的去同步指数存在显著差异。左半球受到的影响略大（左半球失同步指数有6个VOIs，而右半球有4个VOIs）。相反，运动-感觉网络没有显示出任何阶段依赖的去同步指数增加，但在两个感兴趣的区域略有下降（补充图S4）。为了解释多重比较并生成每个受试者的单一读数，作者采用了数据驱动的方法，并比较了CTRL、前驱AD和AD痴呆之间的去同步指数的主要成分（来自上面的十个最高评级的VOIs）。研究结果发现主成分1在组间差异很大（p<0.001），并且在所有组间比较中存在很大的差异（图9D）。

图9. 与对照相比，AD连续体患者小胶质细胞连接组的个性化去同步

结果8.与传统的SUVR分析相比，个性化的小胶质细胞去同步化指数在人类和小鼠队列中都显示了更高的鉴别价值

作者将DI方法从人类队列转换到小鼠队列，以验证比较DI与SUVR的临床价值（补充图S5）。在大多数小鼠队列（10个中有7个例外是PS2APP PLX5622、Trem2^−/−和P301S 2M）和所有人类队列（Cohen’s d>0.8）中，与基于SUVR的分析相比，基于DI的分析显示出更大的区分正常和异常队列的能力。BR量表进一步提高了DI的鉴别价值，在本例中只有一个队列（P301S 2 M）显示DI与SUVR之间没有差异。

此外，在AD连续体的被调查患者中，个体不同步指数与MMSE评分呈负相关。在四个顶叶（Schaefer 72、99、178、199，图10A和补充表S5）和两个颞叶（Schaefer 58、153，图10B和补充表S5）的VOIs中，经过FDR校正后的多重比较观察到显著的负相关。此外，22个顶叶VOIs（Schaefer 99、63、72、81、25、44、149、178、24、46、199、35、96、36、19、62、17、61、34、53、27、141）和8个颞叶VOIs（Schaefer 58、15、153、60、164、152、163、100）的去同步指数与CDR SOB得分呈正相关（补充图S6和补充表S6）。非同步指数的第一主成分与MMSE （r=-0.618, p<0.001，图10C）和CDR SOB （r=0.681, p<0.001，补充图S6）密切相关。综上所述，个性化去同步化指数显示了AD小胶质细胞连接体分期依赖评估的潜力。

图10. 小胶质细胞连接组的个性化不同步与认知表现相关

结果9.单细胞放射性示踪证实小胶质细胞是淀粉样病变存在时区域不同步转运蛋白放射性示踪剂结合的驱动因素

为了研究区域（非）同步的生物学基础和TSPO放射性示踪剂结合的细胞来源，作者对注射TSPO示踪剂后的WT和App^NL−G−F小鼠进行了scRadiotracing（图11A）。由于最显著的同步性变化出现在皮质和皮质下区域之间（补充图S3B），作者分别评估了前脑和后脑区域的细胞TSPO放射性示踪剂摄取。与WT相比，App^NL−G−F中小胶质细胞在细胞产量中的相对比例显著增加（前脑：p<0.01，后脑：p<0.001），而前脑中分离的星形胶质细胞的相对比例降低（p<0.001）（图11B）。与WT相比，App^NL−G−F小鼠表现出增强的小胶质TSPO示踪剂摄取（p<0.001），而星形胶质细胞摄取在基因型之间没有差异（图11C）。重要的是，在WT和App^NL−G−f小鼠中，小胶质细胞对TSPO示踪剂的摄取远远超过星形胶质细胞对TSPO示踪剂的摄取，这表明小胶质细胞是小鼠大脑中区域连接PET信号的主要细胞来源。回归分析发现内皮细胞是小鼠大脑中TSPO-PET信号的另一个相关来源，而神经元、少突胶质细胞和其余细胞仅显示出最小的示踪剂摄取，无论基因型和脑面积如何（补充图S7）。基于每个细胞不同程度的小胶质示踪剂摄取，在淀粉样病变存在时，小胶质细胞显示前脑和后脑之间TSPO摄取的相关性降低（WT中Z=1.33，而App^NL−G−F中Z=0.93），从而减少了前脑-后脑同步性（图11D）。

图11. 单细胞放射示踪揭示小胶质细胞作为AD小鼠 TSPO-PET不同步的生物驱动因素

结果10.光凝血栓性卒中手术引起的急性神经炎症与小胶质细胞不同步有关

最后，作者探索在慢性神经炎症中观察到的小胶质细胞不同步是否也发生在急性神经炎症中。作者在术后7天的光凝血栓性中风小鼠模型中研究了小胶质细胞同步性，并将其与假小鼠进行比较（补充图S9）。与AD小鼠模型相似，中风小鼠表现出明显的去同步化，ICC绝对中位数从0.770（0.363,1.301）下降到0.539（0.241,0.881）。连接的数量从26个减少到7个，皮层-皮层下连接受到的影响最大（从12个减少到0个）。

小结

这项转化性研究将Aβ和tau病理小鼠模型的临床前概念证明与临床神经影像学数据结合起来，为小胶质细胞同步性提供证据，可以通过TSPO-PET在体内评估。小胶质细胞在WT小鼠中表现出同步性，在几乎全部小胶质细胞耗竭时，这种同步性强烈下降。来自AD小鼠模型的数据表明，在功能失调的小胶质细胞存在以及Aβ和tau病理存在的情况下，即使在神经病理发作的阶段，同步性也会丧失。在Aβ小鼠模型中，残余同步性在小胶质细胞减少后进一步减少，从而证明TSPO-PET同步性起源于小胶质细胞。DI测量的小胶质细胞同步性的阶段依赖性下降及其与认知表现的强相关性表明，它有可能成为阿尔茨海默病小胶质细胞连接组的个性化生物标志物。最后，在小鼠体内注射放射性示踪剂后的细胞分选表明，疾病相关小胶质细胞对TSPO示踪剂的摄取具有更高的变异性，这是区域不同步的生物学来源。

这些转化数据首次证明了小胶质细胞连接组可以通过TSPO-PET成像在哺乳动物大脑中进行评估。小胶质细胞不同步与阿尔茨海默病的神经病理特征和认知能力下降有关，个体小胶质细胞不同步指数可以作为个体化免疫生物标志物。

精读论文请下载原文：

Zatcepin A, Gnörich J, Rauchmann BS, Bartos LM, Wagner S, Franzmeier N, Malpetti M, Xiang X, Shi Y, Parhizkar S, Grosch M, Wind-Mark K, Kunte ST, Beyer L, Meyer C, Brösamle D, Wendeln AC, Osei-Sarpong C, Heindl S, Liesz A, Stoecklein S, Biechele G, Finze A, Eckenweber F, Lindner S, Rominger A, Bartenstein P, Willem M, Tahirovic S, Herms J, Buerger K, Simons M, Haass C, Rupprecht R, Riemenschneider MJ, Albert NL, Beyer M, Neher JJ, Paeger L, Levin J, Höglinger GU, Perneczky R, Ziegler SI, Brendel M. Regional desynchronization of microglial activity is associated with cognitive decline in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2024 Sep 5;19(1):64. doi: 10.1186/s13024-024-00752-6.