1 （增补印刷）神经科学实用图书推荐——《鼠脑应用解剖学》【科学出版社】
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是常见的神经退行性疾病之一，目前我国患病人数约为350-400万，而随着人口老龄化的加剧，预计到2030年PD患者将增加到500万。越来越多的证据表明，外周免疫细胞和循环介质（包括小胶质细胞和T细胞）的异常激活会导致帕金森病的神经退行性变和疾病进展[1-5]。调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）是一种免疫抑制性T细胞亚群，是神经炎症耐受的重要调节因子，可维持中枢神经系统（CNS）和外周循环的免疫稳态[6-9]。研究表明，帕金森病模型中Tregs的增加可显著防止多巴胺能神经元的损失和行为变化，并减轻中枢神经系统的炎症反应[6,8,10]。重复性经颅磁刺激（Repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS）是一种安全、无创的神经调控技术，已用于改善PD的运动症状[11-14]。然而，rTMS对PD治疗作用的具体分子机制尚未阐明。有研究表明，rTMS可以通过影响炎症和抗炎因子在PD患者和动物模型中发挥保护作用[15-17]。因此，作者假设rTMS可能通过调节Tregs细胞从而发挥PD治疗作用，并据此设计实施了一项前瞻性临床试验和相关动物实验。
南方医科大学珠江医院王青教授团队继前日在Science advances，Brain、eClinicalMedicine、NPJ Parkinson’s Disease、eBioMedicine和Aging and Disease等国际权威杂志发表数篇高水平文章后，近期王青教授团队联合新加坡National Neuroscience Institute 的EK Tan 和 英国Kings College的K Ray Chaudhuri等PD专家，又在Molecular Neurodegeneration（中科院一区，IF：14.9）顶刊杂志上发表了题为“Repetitive transcranial magnetic stimulation alleviates motor impairment in Parkinson’s disease: association with peripheral inflammatory regulatory T-cells and SYT6”的原创性（Original article）临床+基础论著文章。珠江医院神经内科的谢芬、沈壁标、罗玉淇为共同第一作者，王青教授为最后通讯作者，南方医科大学珠江医院为论文第一署名单位。该研究受到国家自然科学基金和广州市科技计划基金等多项基金资助完成。
这篇研究发现rTMS可增加PD患者外周血Tregs细胞比例，改善运动功能障碍。rTMS也可以改善MPTP诱导的小鼠行为学损伤，逆转这些小鼠循环Tregs和酪氨酸羟化酶神经元的下调，并减轻了炎症细胞因子。Treg抑制剂anti-CD25抗体可以阻断rTMS这些治疗作用。rTMS逆转TH损伤、降低炎症因子水平的治疗效果也依赖于Tregs关键枢纽蛋白Syt6的正常表达。总的来说，这些临床和实验研究表明，rTMS通过调节Tregs的功能和抑制毒性神经炎症来改善PD运动功能，关键枢纽蛋白Syt6可能是潜在的治疗靶点。
（拓展阅读：王青课题组最新进展，详见下列报道（点击阅读）：
NPJ PD：珠江医院王青团队报道视网膜厚度与帕金森病非运动症状的关联｜
一、
本研究纳入的54例PD患者分为两组，一组在运动皮层M1区接受10天的rTMS （10 Hz）治疗，另一组接受假rTMS治疗，随后在第1、13、19和40天进行Hoehn和Yahr以及MDS-UPDRSⅲ评估。与对照组相比，接受rTMS治疗的PD患者的MDS-UPDRS第三部分评分显著降低。作者使用流式细胞术测量了两组患者外周血的抗CD4、CD25和CD127抗体水平，结果显示10天的rTMS治疗显著提高了PD患者的外周血Tregs水平。Pearson相关分析发现在接受rTMS治疗的PD组中，Tregs比例的增加与MDS-UPDRSⅲ评分的变化呈负相关。这说明rTMS可增加PD患者外周血Tregs细胞比例，改善患者运动功能障碍。（见图1）
图1 rTMS治疗改善了PD患者的运动功能，增加了外周Tregs的比例
二、
rTMS挽救了MPTP诱导的小鼠的多巴胺能神经元丢失，逆转了外周循环中Tregs比例下降，并减轻了炎症细胞因子。作者接下来试图在帕金森病动物模型中验证以上的临床发现。作者用MPTP诱导出了小鼠的PD样症状，使用rTMS（10 Hz）治疗改善了这种损害。与生理盐水对照组小鼠相比，MPTP诱导的小鼠在爬杆测试中花费更多时间来掉头和向下攀爬，而经过rTMS治疗的小鼠所用时间明显减短，然而，Treg抑制剂anti-CD25显著消除了这种改善。
作者还通过免疫组化染色检测到MPTP给药后小鼠黑质中多巴胺能神经元、BDNF和GDNF的丢失。而与MPTP组或假rTMS组相比，MPTP+rTMS（10 Hz）组的TH、BDNF和GDNF显著增加。作者进一步通过免疫荧光染色检测了MPTP给药后小鼠黑质中小胶质细胞激活与炎症因子表达的情况，与生理盐水对照组小鼠相比，MPTP小鼠黑质中有大量小胶质细胞被激活，腹侧中脑的促炎细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-1β显著增加而抗炎细胞因子IL-10和TGF-β1则显著降低，外周循环中的Tregs细胞比例也显著下降。经过rTMS（10 Hz）治疗后则显著逆转了这种损伤：与假治疗组小鼠相比，rTMS治疗显著逆转了PD小鼠循环中Tregs细胞比例的下降，在PD小鼠腹侧中脑的抗炎介质IL-10和TGF-β1显著增加而炎性细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-1β显著减少。这一发现表明rTMS治疗PD小鼠可以减轻脑内炎症。而在PD小鼠使用Treg抑制剂anti-CD25注射后则看不到上述rTMS介导的循环Tregs和抗炎细胞因子的增加，炎症细胞因子下调，以及黑质中小胶质细胞活化减少的治疗效果。这说明Tregs在rTMS挽救PD小鼠中脑多巴胺能神经元、减轻炎症细胞因子发挥重要作用。（见图2、图3)
图2 rTMS治疗可改善行为障碍，增加Tregs的比例，抑制MPTP诱导的PD小鼠的神经炎症反应。
图3 rTMS治疗增加了MPTP诱导的PD小鼠黑质中TH和神经营养因子BDNF和GDNF的表达。
三、
为了进一步鉴定与rTMS治疗PD引起Tregs比例上升相关的分子靶点和关键蛋白，作者使用串联质谱标签（TMT）技术对4个组（对照组、MPTP组、MPTP+ rTMS组、MPTP+block+rTMS组）进行定量蛋白质组学分析。通过两两比较和蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析确定了Syt6和Slc6a3参与了多条通路，并与T细胞的活化相关。使用ZDOCK算法和蛋白质组学分析提示TLR4和SYT6之间可能存在蛋白相互作用，且两种蛋白相互作用可能通过多个结合位点发挥生物学效应，这些蛋白被认为是枢纽蛋白，可能成为PD的新靶点。作者通过蛋白质印迹法验证了这些筛选的关键蛋白。与生理盐水对照组相比，MPTP诱导的PD小鼠脑内Syt6和TLR4水平分别显著升高，TH和Slc6a3水平显著降低，而rTMS治疗逆转了这些变化。更有趣的是，在用抗CD25抑制Tregs细胞后，rTMS这种逆转效果消失。这说明了Syt6是rTMS介导Tregs治疗机制中的关键枢纽蛋白。（见图4 )
图4 定量蛋白质组学分析鉴定出与rTMS治疗MPTP诱导PD小鼠引起的Tregs上升相关的下游靶点Syt6、TLR4、TH和Slc6a3
四、
作者通过立体定位法将腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体注入中脑以阻断Syt6表达。采用免疫荧光染色和WB检测转染效率并确定使用阻断效果最好的第3号Syt6-shRNA-AAV。与MPTP组相比，敲除Syt6的MPTP组黑质中Syt6表达量显著降低，且小鼠的爬竿测试成绩显著提高。有趣的是，rTMS治疗并没有改变携带Syt6-AAV的MPTP小鼠的总攀爬时间而是显著降低Syt6-AAV空载病毒组MPTP小鼠的总攀登时间。作者接下来检查注射Syt6-AAV腺相关病毒对MPTP+rTMS治疗组小鼠的Syt6、TLR4、TH和炎性细胞因子的影响。结果发现注射了Syt6-AAV后MPTP小鼠的TH表达量显著增加而Syt6表达显著降低，rTMS没有改变Syt6-AAV+MPTP组小鼠的TH、Syt6、TLR4、IL-β1、TNF-α和IL-6。相反，rTMS显著降低了Syt6-AAV空载病毒+MPTP组小鼠的IL-β1、TNF-α和IL-6水平且增加TH蛋白水平。这说明rTMS逆转TH损伤、降低炎症因子水平的治疗效果依赖于Syt6的正常表达。此外，MPTP组小鼠黑质中抗炎细胞因子如IL-10和TGF-β在敲低Syt6后没有改变，而在rTMS治疗后其水平显著升高。在IBA-1阳性细胞中也检测到Syt6的表达。上述这些数据表明，rTMS治疗通过影响枢纽蛋白Syt6，从而增加MPTP小鼠Tregs的比例。（见图5、图6）
图5筛选出有效的干扰syt6的病毒条带，以确保干扰效率
图6 采用病毒干扰syt6法验证syt6蛋白在rTMS治疗MPTP诱导的PD小鼠引起其外周脾脏中Tregs比例上升中的作用
文章结论、启发与展望
王青教授团队在帕金森病患者和动物模型的临床和实验室研究表明，rTMS通过调节外周Tregs细胞的功能和抑制毒性神经炎症来改善PD运动功能。作者还鉴定了一些可能的潜在治疗枢纽靶点蛋白（尤其是Syt6）。作者的研究结果为rTMS治疗帕金森病的神经调节作用提供了病理生理学见解。在未来进行相关临床试验中，作者将进一步运用纵向研究来确定rTMS刺激后的循环Tregs水平是否可以用于监测帕金森病的临床进展。
通讯作者：王青（图源：珠江医院王青团队）
王青，南方医科大学珠江医院神经内科主任，中南大学湘雅医学院临床本科，National University of Singapore博士，Stanford University（博士后，PI），Australia NHMRC Fellow，博士生导师，博士后合作导师；原中山大学“百人计划”引进人才（2009年），美国神经科学会会员, 亚太神经化学学会委员，首届中国医师协会“十大杰出神经内科青年医师奖”，“广东特支计划”百千万工程领军人才，广东省医学杰青。中华医学会帕金森及运动障碍委员，广东省医学会帕金森病及运动障碍学组组长，Aging and Disease、Experimental Neurology等杂志编委，承担了973，重大研发计划子课题、国家自然科学基金等40余项，文章被引4500余次，以最后通讯作者在Molecular Neurodegeneration、Science Advances、eClinicalMedicine、Brain、Progress in Neurobiology、Movement Disorders、NPJ Parkinson’s Disease、eBioMedicine、Briefings in Bioinformatics、Aging and disease、Cell Death and Disease、British Journal of Pharmacology、Neurobiology of Disease、Molecular Neurobiology等国际杂志发表SCI论文90余篇。
原文链接：
https://doi.org/10.1186/s13024-024-00770-4
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