Science Immunology：双胞胎研究鉴定多发性硬化症中CD8+T细胞的早期免疫和代谢失调

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的炎症性神经系统疾病，在明显的神经炎症之前具有亚临床阶段。在MS病灶中存在大量的CD8+T细胞，但其在疾病病理学中的潜在作用仍不清楚。近期，《Science Immunology》期刊发表了题为“Twin study identifies early immunological and metabolic dysregulation of CD8+T cells in multiple sclerosis”的文章，作者团队使用高通量的单细胞RNA测序和单细胞T细胞受体分析，比较了来自同卵双生子的血液和脑脊液（CSF）中的CD8+T细胞克隆，其中双生子没有或有亚临床神经炎症（SCNI）。作者团队确定了外周MS相关的免疫和代谢改变，表明迁移性、促炎性和活化的CD8+T细胞表型增强，这在SCNI双胞胎和MS患者的独立验证队列中也很明显。总之，作者团队深入的单细胞分析表明浸润性CD8+T细胞的疾病驱动促炎作用，并在疾病的前驱期和最终阶段鉴定了潜在的免疫和代谢治疗靶点。

多发性硬化症（MS）是一种由遗传和环境因素相互作用引起的炎症性神经系统疾病。先前对外周血单核细胞（PBMC）区室的横断面研究已经提供了对MS病理学基础的广泛炎症过程的见解，但仍不清楚这些过程如何由MS患者的不同遗传背景及其不同的早期环境暴露形成。MS双胞胎研究克服了这些局限性，在该研究中，MS不一致的单卵双胞胎的大型队列代表了具有相同遗传和早期环境风险因素的理想匹配病例对照组，因此可以识别与MS特异性相关的免疫学改变。

MS 双胞胎研究包括MS患者及其双胞胎（他们也有25%的风险发展为MS）。队列中一部分临床健康的双生子显示出基于磁共振成像（MRI）和/或脑脊液（CSF）的亚临床神经炎症（SCNI）体征，但不符合MS的临床和放射学标准，代表最早可检测到的前驱疾病阶段。先前对该队列的外周CD4+T细胞区室的研究确定了疾病相关的变化，包括CD4+暂时性幼稚亚群中CD25- IL-2轴的失调。在人类中，MS病变中的促炎CD8+T细胞数量超过CD4+T细胞，并显示出克隆扩增的迹象。双胞胎CSF内CD8+T细胞的单细胞RNA测序（scRNA-PCR测序）证实，这些细胞在MS-和SCNI-感染组中均被激活并扩增，表明在前驱期可能起作用。然而，在外周血中启动并导致CNS迁移和CD8+T细胞的促炎性活化的失调机制的细节仍不清楚。

在此，我们从MS双胞胎研究队列中选择了12对双胞胎，代表一个子队列，包括12个MS-感染个体和他们的非神经炎性（n = 6）或SCNI-感染（n = 6）的双胞胎。然后，我们应用高通量scRNA-测序和单细胞T细胞受体（TCR）测序来表征各组中外周和CNS-迁移的CD 8+T细胞，揭示了不同的MS-相关免疫和代谢改变.这些数据为进一步了解疾病发作和表现的病理机制铺平了道路，并确定了MS靶向诊断和治疗方法的潜在前景。

我们从12对双胞胎中产生了外周CD8+T细胞的单细胞转录组和TCR序列谱，其中包括12名MS患者，6名具有SCNI体征的同卵双胞胎和6名临床上健康的人（图1A、图S1A、表S1和图S1C，每个个体的绝对细胞数）。质量控制后，分析了来自193771个CD8+T细胞的数据：无偏差异基因表达（DGE）方法表征了12个T细胞簇，根据主要基因表达进行标记（图1B和表S3）。1_CCR7 T细胞簇显示出幼稚T细胞特征（CCR7、LEF1、MAL、MYC、SELL、LDLRAP1、LDHB、NOSIP、TCF7、PIK3IP1和NELL2）（图1C），而从2_NELL2到5_MAL的簇显示出幼稚型表达水平向效应型表达水平的过渡（图1C和图S1、B和D）；簇9_IKZF2和10_FGFBP2表现出效应子样特征（CX3CR1、GNLY、GZMH、FGFBP2、FCGR3A、PLEK、ADGRG1和PRF1）（图1C和D，图S1 D），而簇6_GZMK和8_CD84表达与人淋巴细胞抗原（HLA）II类呈递相关的基因（CD74、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQB1和HLA-DRB5），先前报道与T细胞活化相关（图1E，图S1D）;此外，簇7_MX1被分类为参与IFN-γ相关信号传导（MX1、ISG15、IFI6和IFI44L;图S1B）。剩余的T细胞簇是自然杀伤（NK）样T细胞群（表达KLRC2、FOS、ZNF683和NCR3;图S1B）和粘膜炎性相关不变T细胞（MAIT;基于KLRB1、NCR3和TRAV1-2;图S1B）对这些簇内细胞分布的分析显示，不同临床状况之间无显著差异（图S1E）。伪时间分析进一步描绘了从幼稚细胞样簇1_CCR7向效应细胞相关簇的轨迹，簇9_IKZF2和10_FGFBP2表现出最高的伪时间分数（图S1F）。

我们的单细胞TCR-repertoire数据支持表型分析：尽管在初始（1_CCR 7）、过渡（2_NELL2、3_NT5E、4_CD82和5_MAL）和NK样T细胞簇内扩增细胞的分数低，但与活化（6_GZMK和8_CD74）和效应样（9_IKZF 2和10_FGFBP 2）特征相关的T细胞群体显示扩增细胞的分数增加（图S1 G）。我们的分析显示，当比较来自受累和临床健康双胞胎的PBMC时，每个簇的扩增细胞分数没有显著差异（图S1 H）。

为了了解外周血中存在的这些细胞簇中的哪些可能参与CNS中的MS病理，我们将T细胞克隆型分析应用于来自四个双胞胎对的子集的PBMC和CSF的匹配同期样品（图1F）。通过比较两个区室中T细胞的CDR3 TCR区域，我们鉴定了血液和CNS中均存在的那些克隆型（图1G和H）。尽管血液和CSF中存在初始和暂时性T细胞簇内的少数克隆型，但与活化和效应信号传导相关的那些簇在区室之间显示出高达21%的重叠。这些簇在两个区室中具有最多扩增的克隆（图S1I），其中8_CD74 T细胞簇显示出最高程度的重叠（图1I）以及CSF区室内扩增细胞的最高分数（图S1J）。在血液和CSF中发现的一些扩增最多的克隆型仅属于MAIT簇（图S1I），这些克隆共享不变的TCRα。然而，血液和CSF之间的MAIT簇的重叠低于5%（图1I），并且没有表现出效应样或活化T细胞特征（图1D和E）。因此，我们将我们的进一步分析集中在簇8_CD74、6_GZMK、10_FGFB2和9_IKZF2作为可能的疾病相关T细胞亚群。

图1：对同卵双生子CD8+T细胞进行多模式单细胞分析，鉴定血液和脑脊液中的活化克隆型

在使用双胞胎队列进行DGE分析之前，我们考虑了可能的混杂因素，包括可能影响PBMC区室中免疫细胞组成的疾病修饰治疗。我们鉴定了在MS-感染亚组中最高差异上调基因中干扰素-相关标记的存在（n = 4 干扰素-β治疗的患者;参见图S2）。因此，我们接下来将过滤DGE算法应用于我们的组群：首先，我们排除干扰素-β 治疗的患者的影响，然后我们考虑亚组内的患者异质性，最后，我们选择在血液和CSF中存在的T细胞克隆型内表达的那些剩余基因用于进一步分析（图2A）。使用非成对比较使我们能够对比每个感兴趣的簇中的基因表达（8_CD74、6_GZMK、10_FGFB2和9_IKZF 2），从而鉴定在健康个体和患有SCNI的个体（组合结果，图2B和表S4），以及在健康和MS-感染的个体之间（组合结果，图2C和表S5）和在SCNI和MS-感染的个体之间的外周T细胞之间差异表达的基因（表S6）。

我们发现，来自SCNI-T细胞和MS-T细胞感染个体的外周CD8+T细胞特异性表达与T细胞活化能力增加相关的基因特征：除了典型的激活标记（CD27和CD69），它们表达COTL 1 [coactosin样蛋白，其在TCR/CD28-介导的共活化后支持T细胞扩散]和ANXA 5 [annexin A5，其对于T细胞活化期间的NF-κB活化是必需的]。与来自没有神经炎症的个体的细胞相比，与增加的促炎能力一致，来自SCNI-和MS-感染个体的CD8+T细胞也高度表达参与HLA II类抗原呈递的基因（CD 74、HLA-DQB 1和HLA-DRB1）和细胞毒性信号传导（GZMH、GZMK、KLRB1和KLRD 1），提示这些亚群可能在前驱和显性MS中起致病作用（图2B和C）。

接下来，我们比较了来自三组患者的外周CD8+ T细胞的DGE以揭示亚组特异性特征，并进行基因集富集分析（GSEA）以鉴定差异调节的信号传导途径。使用分子特征数据库（MSigDB）和enrichR算法，我们发现在SCNI-和MS-亚组中，干扰素-γ应答级联在最高富集途径中（图2D和E）。SCNI-亚组进一步显示出IL-12/信号转导和STAT 5相关通路的富集，而MS亚组的标志是通过NF-κB上调TNF-α信号转导。在SCNI和MS中，代谢途径“氧化磷酸化”显示出最富集。这种代谢适应是T细胞持续活化所必需的，这再次与该细胞群的疾病驱动作用一致。

最后，我们使用MSigDB、Reactome和Biological Processes：Gene Ontology（BP：GO）数据库来丰富与GSEA鉴定的途径相关的基因列表，并创建新的参考（表S8）。我们在DGE比较的基础上检索了上调的标志物（图S3和S4），并分析了标签之间共享基因的数量，这揭示了富集的免疫途径是高度互连的（图2F），表明了免疫失调的共同模块。

首先，我们评估了相关外周T细胞亚群中属于相互关联的免疫级联反应的基因表达的变化。（8_CD74、6_GZMK、10_FGFB2和9_IKZF2），代表MS的三个阶段。通过根据临床状态合并和分类标记，我们发现IL 2 RB在SCNI亚群中主要上调（图3A），与CD8+T细胞的早期活化在疾病的前驱期开始的观点一致；与此相反，来自MS患者的T细胞上调了与蛋白酶体降解相关的基因（PSMB9、PSME2、PSMB8和PSMB7）和HLA II类抗原递呈（CD 74、HLA-DRA和HLA-DRB5）。绘制具有最高免疫标记表达的细胞显示，在健康个体中存在很少，在SCNI-感染个体中存在中等数量，在MS-感染个体中存在明显更多（图3B）。这一发现强调了疾病相关的CD 8 + T细胞的免疫改变在前驱疾病阶段开始，并随着疾病的进展而固化。

在下一步中，我们根据其分子功能将富集途径内鉴定的标志物分类为免疫学模块，全面描绘疾病相关的CD8+ T细胞内的免疫改变。我们对来自SCNI-和MS-个体的细胞的表达值进行标准化，以相对于健康组群量化这些改变。除了先前描述的与T细胞增殖和活化相关的IL 2 RB之外，我们鉴定了参与TCR信号传导的几种分子（包括LIME1和CD27）（图3C）。IL-12受体和TCR复合物信号轴都可以激活MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）信号，导致下游元件JAK3、MAP4K1、RRAGA、LAMTOR2和LAMTOR4的上调，这可能导致SCNI-和MS-感染个体内T细胞活化增加。与升高的活化一致，我们观察到与HLA II类抗原呈递、泛素化、蛋白酶体蛋白降解和HLA II类肽负载相关的分子的高表达，表明SCNI和MS中CD8+T细胞的抗原呈递能力增加。

除了增加的蛋白质活化，我们检测到VAMP5和VAMP8的上调，表明来自SCNI-和MS-个体的外周CD8+T细胞中蛋白质分泌增加；这些细胞还表达编码细胞毒性（GZMK、GZMA和GZMM）和效应分子（CCL 5、FLT3LG、MYDGF、MF和IL32）的基因。在这些效应基因的产物中，CCL5是巨噬细胞、树突状细胞（DC）、T辅助细胞1（TH 1）细胞和NK细胞的有效化学引诱物，而FLT3相关酪氨酸激酶3（FLT3）配体（FLT3LG）促进DC分化和抗原交叉呈递，并且IL-32诱导TNF-α、IL-6、IL-1β系统性产生，这些炎症因子已经显示在其他自身免疫性疾病的发病机制中起关键作用，例如类风湿性关节炎和1型糖尿病。此外，我们观察到与T细胞毒性（KLRK1、KLRD1和KLRB1）、活化（CD69和CD27）以及促进T细胞和抗原呈递细胞（CD6）之间的粘附相关的细胞表面分子的表达增强。SELL的高表达表明高迁移潜力，SELL编码L-选择素（CD62L），其促进白细胞-内皮细胞粘附，也编码CXCR3，一种支持T细胞迁移到CNS的趋化因子受体。总之，这些分子的上调表明，CD8+T细胞可能具有有效的效应状态，并且可能能够将其他免疫细胞动员到前驱和显性MS中的神经炎症部位。

接下来，我们研究了遗传背景作为上述非成对比较中可能的混杂因素的影响，方法是在MS与健康双胞胎对以及MS-双胞胎与SCNI-双胞胎受影响的双胞胎对（每个比较中有6对双胞胎对）中进行基于DGE的成对比较，这是通过考虑患者异质性的过滤算法实现的。与健康个体和SCNI-感染的个体相比，大多数标志物在MS个体中显示上调（图3D），证实MS中疾病相关的CD8+T细胞的增强的活化、迁移和效应能力是MS疾病过程的特征，而不是MS易感性的遗传学特征。

图3：外周血疾病相关的CD8+T细胞上调与增强的活化、抗原呈递、CNS迁移和效应分子产生相关

鉴于与氧化磷酸化相关的代谢信号级联是感兴趣的外周血T细胞亚群中最丰富的途径之一，（8_CD74、6_GZMK、10_FGFB2和9_IKZF 2），我们接下来将来自DGE分析的上调基因映射到来自Reactome，BP：GO和MSigDB，使我们能够剖析MS-相关的CD8+T细胞中的代谢改变。通过根据不同条件下的z-分数对标记进行排序，我们鉴定了GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4），一种已知具有抗氧化功能的酶，是SCNI亚组中表达最高的基因之一（图4A），而MS-个体的T细胞高度表达与葡萄糖摄入（SLC2A3，也称为GLUT3）、糖酵解（GAPDH和LDHB）、柠檬酸循环（MDH2和IDH2）（图4A）和呼吸复合物I（包括NDUFA 13）密切相关的因子。然后，我们计算了单细胞代谢富集分数，其显示了代谢改变向MS-的增加，类似于免疫学改变的增加（图4B）。具有最高代谢富集评分的大多数T细胞位于8_CD74簇内，与活化特征相关，并显示PBMC和CSF中存在的克隆型比例最高。

随后，我们的目标是通过根据其分子功能对其进行分组，并随后进行如上所述的标准化，以更好地了解这些代谢改变的分子基础。首先，我们鉴定了SLC2A3，其促进葡萄糖内流，在SCNI-和MS-个体的细胞内高度表达（图4C）。我们还观察到参与糖酵解（TPI1，GAPDH和LDHB）和柠檬酸循环（MDH2和IDH2）的分子表达增强。与电子传递链相关的其他关键分子，包括复合物I、III和IV，以及腺苷5′-三磷酸（ATP）合酶，也在SCNI-和MS-感染的双胞胎的CD8+T细胞中高度表达。最后，我们发现与活性氧（GPX4，SOD1，GLRX和PRDX5）的中和相关的分子的表达增强，预计将在氧化磷酸化增加的背景下产生。

最后，我们研究了遗传背景的影响，作为一个可能的偏差在识别代谢目标。在MS的双胞胎与健康双胞胎以及MS双胞胎与SCNI双胞胎中的基于成对DGE的比较显示鉴定的标记物的一致上调（图4D），强调如果我们控制MS遗传学，我们观察到的代谢改变仍然存在。

总之，我们的分析显示，在SCNI和MS中，与疾病相关的CD8+T细胞中的能量产生能力相关的基因的高表达。T细胞的这种增强的代谢适应性与这些细胞维持能量产生需求效应功能的能力紧密相关，这一发现得到以下证据的支持：抑制复合物I，III，ATP的合成可以完全阻断CD8+T细胞的活化。

图4：代谢模块分析显示SCNI和MS亚组的能量代谢上调

我们接着研究在其他MS患者中是否存在相同的CD8+T细胞特征。我们从未经治疗的复发环节型MS患者的独立验证队列中收集PBMC和CSF样品（RRMS; n=12，除1例个体在采样前3周接受富马酸二甲酯治疗外;表S2）和患有特发性颅内高压（IIH）的个体作为非神经炎性对照（n=5）。

在质量控制后，我们使用Symphony算法将来自PBMC的89859个CD8+细胞的转录组学数据与来自双胞胎群组的T细胞作为参考作图，以保留原始聚类（图5A和B，每个个体的绝对细胞数在图5A中描绘）。通过仔细检查细胞在鉴定的簇中的分布，我们观察到簇1_CCR7和9_IKZF2在未经治疗的RRMS-个体的PBMC内的显著富集（图S5B）。此外，我们注意到簇9_IKZF2内的T细胞扩增速率更高（图S5C）。此外，使用来自匹配的CSF样品的单细胞TCR数据，我们鉴定了存在于两个隔室中的那些克隆型：如在发现队列中，常见克隆型的最高比例在簇6_GZMK、8_CD74中（与活化信号传导特征相关）、9_IKZF2和10_FGFBP2（与增加的效应能力相关），在簇8_CD74的情况下达到几乎50%（图5B和图5D）。

聚焦于含有最常存在于血液和CSF中的克隆型的这些簇，我们如前所述进行无偏DGE分析，但不需要过滤治疗效果（图5C）。我们发现组群中的许多差异调节基因也在来自验证组群中患有MS的个体的CD8+T细胞中差异表达，包括指示增加的T细胞活化、MAPK信号传导（MAP3K8、PIK3R1和RRAGA）和细胞毒性能力（KLRB 1、KLRD1和KLRC4）的分子（图5D和表S7）。使用GSEA，我们再次注意到在MS-富集级联中的“氧化磷酸化”、“经由NF-κB的TNF-α信号传导”、“PI3K/AKT/mTOR信号传导”、“干扰素γ应答”和“IL-12/STAT 5信号传导”（图5E），每一个先前已经在SCNI-或MS-的双胞胎亚组中富集。

在发现和验证队列中，来自MS-个体的疾病相关CD8+T细胞之间出现了额外的相似之处，包括涉及以下基因的较高表达：（RRAGA、HLA-DRA、HLA-DMA和HLA-DRB5）;泛素化、蛋白酶体蛋白降解和HLA-II类抗原呈递（PSMB6、PSMD8、UBB和HLA-E）;和与增加的效应功能和迁移能力相关的基因（CXCR3、KLRB1、KLRD1、GZMM和CCL5）（图5，F, G）。总之，这些表达模式表明，来自MS的疾病相关CD8+T细胞的代谢能力增强（图5H, I）。

因此，我们的独立验证队列证实了存在不同的促炎免疫学和代谢改变，这与MS前驱期和显著期中存在的疾病相关CD8+ T细胞的增强的活化状态、代谢能力和效应功能一致。

图5：对独立验证队列的单细胞分析证实了未经治疗的MS中疾病相关CD8+T细胞的免疫学和代谢改变

随后，我们的目的是确定是否显著的免疫和代谢的变化也明显存在于MS病变的T细胞。利用公开可用的数据集，我们分析了来自患有MS的个体和相应对照的单核细胞核谱。遵循严格的质量控制程序，我们分别分析了来自16403（图6A和图S6A）和45131个单核细胞核谱（图6D和图S6C）的数据，特别关注免疫细胞群体并进一步将其重新分类以分离T细胞，如通过无偏DGE方法所证实的（图S6A, C）。在两个数据集中，MS病变内存在的T细胞主要是CD8+谱系，并表达组织-细胞驻留记忆表型的特征性模式（图6 B和图S6 B）。

接下来，使用无偏DGE方法，我们从MS病变中提取T细胞相关基因，并基于MS 双胞胎队列将它们映射到先前鉴定的免疫和代谢模块上。来自Jäkel等人数据集的T细胞与T细胞活化和HLA I/II类抗原呈递（CD74、CD69、PSME1、PSMB8和PSMB8），细胞毒性（KLRB1、KLRD1、GZMM、GZMA和GZMK）、效应分子的产生和细胞-细胞相互作用(CCL 5、IL 32和CD6）、葡萄糖转运蛋白SLC2A3（也称为GLUT3）和电子转运链元件（COX7A2和COX4I1）相关的差异表达元件（图6C）。类似地，Schirmer等人的数据集的T细胞高度表达与T细胞活化和HLA I/II类抗原呈递（CD74、PSMB8、HLA-E、HLA-B、HLA-A、HLA-DRA、HLA-DPA1、HLA-DRB1和HLA-DRB5）以及效应分子的产生和细胞间相互作用（GZMA、IL 32、CCL5和CD6）相关的分子（图6E）。

此外，鉴于先前的观察结果表明自身免疫性疾病中杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）+CD8+T细胞的存在增加，提示对病原性再活化的抑制功能，我们检查了两个数据集中MS病变中存在的T细胞内KIR转录物的表达。出乎意料的是，我们的分析揭示了Jäkel等人数据集中不存在KIR转录物，并且Schirmer等人数据集中的T细胞中没有KIR2DL1和KIR 2DL3的表达（图S6D）。这是值得注意的，因为它进一步支持了所鉴定的T细胞表型的促炎性质，为MS病变内CD8+T细胞的持续活化能力提供了额外的证据。

总之，我们的单核细胞脑组织分析证实了MS病变中的T细胞表达先前鉴定的疾病相关免疫和代谢模块的关键要素。这些发现强调了MS病变内CD8+T细胞的持续活化，伴随着能够将其他免疫细胞亚型募集到神经炎症部位的效应分子的表达。

图6：脑组织单核细胞分析显示，MS病变中的T细胞表达先前确定的免疫和代谢模块的关键要素

作者团队使用高通量的单细胞RNA测序和单细胞T细胞受体分析，比较了来自同卵双生子的血液和脑脊液（CSF）中的CD8+T细胞克隆，其中双生子没有或有亚临床神经炎症（SCNI）。作者团队确定了外周MS相关的免疫和代谢改变，表明迁移性、促炎性和活化的CD8+T细胞表型增强，这在SCNI双胞胎和MS患者的独立验证队列中也很明显。总之，作者团队深入的单细胞分析表明浸润性CD8+T细胞的疾病驱动促炎作用，并在疾病的前驱期和最终阶段鉴定了潜在的免疫和代谢治疗靶点。