人类蛋白质组是基因组中~20,000个基因编码的蛋白质及异构体的总和,尽管知道哪些基因以及何时表达很重要,但人类蛋白质组的全面表征仍然是困难重重。在过去的十年中,许多研究团队建立了基于质谱的深度人类蛋白质组,其中有报道超过10,000个蛋白的。但是要达到这种覆盖深度,必须进行离线预分离和漫长的采集时间。例如,最近报道的人类蛋白变异体和异构体的整体检测,包括17,717个蛋白,中位序列覆盖率为80%。与人类蛋白质组的其他方案一样,这样的结果需要多种细胞系,多种蛋白酶处理和广泛的分级,全部包括数千小时的样品制备和 LC-MS/MS 采集时间以及无数小时的数据分析。
现代蛋白质组学的应用通常需要对样本进行快速分析,新的仪器使得前体采样率达到前所未有的水平;但也提出了对新颖的、高通量的方法的需求。而新的赛默飞Orbitrap Astral质谱仪的出现,使研究人员们追求的性能的飞跃得以实现。Astral与高分辨率精确质量(HRAM) Orbitrap分析仪一起集成,引入了与离子检测的下游速度一致的快速切换四级杆滤质器,双压离子处理器单元,其在高压单元中离子被移动到低压单元以进一步积累和正交提取到Astral分析仪前将其子碎片化 ,以及高动态范围检测器。总之,离子可以同时在质谱的五个阶段(Orbitrap,多级离子通道,两个离子处理器阶段,Astral分析仪)被操纵,允许高度的并行性,使 MS/MS 扫描速度达到200Hz,而 HRAM MS1全面扫描是在 Orbitrap 分析仪中同步获得的。为了提供如此快的扫描速度,Astral分析仪能够像线性离子阱一样具有单离子检测灵敏度,同时能够在 m/z 524时具有80,000的分辨能力。
本研究作者优化了一种用于快速蛋白质组分析的 LC-MS/MS 方法和第二种旨在深入探索人类蛋白质组的较长方法。为了检查非常快速的分析时间,作者使用捕获和洗脱,微流 LC 配置用于快速肽加载和平衡,使用7分钟的活性梯度分离200ng 肽并消耗 LC-MS/MS 总时间8分钟。作者用于探索更深覆盖的方法使用直接注射构型和40厘米纳米毛细管柱在7,15,30或60分钟梯度上分离1μg 肽,分别消耗 LC-MS/MS (注射到注射)总时间8,41,56或85分钟。将分离方法与新的Orbitrap Astral系统结合起来,使能够以前所未有的速度和深度探索各种方法;并通过将Astral分析仪与四极轨道分析仪(Q-OT)相结合,可以获得近200Hz 的串联质谱,同时在Orbitrap 分析仪中同步获得 HRAM MS1扫描。
在每种1μg 肽的色谱方法中,DIA 模式下的 Q-OT-Astarl 质谱收集了2847次 MS1扫描,288,422次 MS/MS 扫描(15分钟);4319次 MS1扫描,438,062次 DIA MS/MS扫描(30分钟);和7264次 MS1扫描,平均737,451次 MS/MS 扫描(60分钟)。在相同梯度长度上的最佳 DDA 方法产生的 MS/MS 扫描的平均值为 DIA 方法收集的67.5% 。
在7分钟内,通过微流动色谱法,平均收集了787个 MS1扫描和82,117个 DIA MS/MS 扫描。快速扫描速度和 HRAM 测量对包含快速梯度的 LC-MS 实验至关重要。由于多种特征在快速连续洗脱,仪器必须能够采样每个离子包足够快,并有足够的纯度定量准确性,而不牺牲覆盖深度。为此,作者探讨了窄窗 DIA 方法如何提供与 DDA 方案相当的谱图纯度,可以有利于分析由短梯度分离的复杂蛋白质组混合物(图1)。Astral灵敏度的提高使得注射时间达到3ms,与窄的2Th 窗口 DIA 方法兼容,这种方法必须每秒钟通过数百个窗口进行光栅化。尽管15分钟方法中的典型2 Th 窗口共分离四种或更少的肽,但将该窗口在计算机上扩展到4 Th 和6 Th 将共分离的前体的数量增加到超过10个,大大增加了光谱复杂性(图1)。
上图给出了一个跨越30分钟活性 LC 梯度的 Q-OT-Astrial DIA 的例子,在22.02分钟的保留时间下,获得 Orbitrap MS1(分辨率为240,000在 m/z 200) ,Astral同步获得而超过100个 DIA MS/MS 。对于从650到700的前体 m/z 范围,~150ms获得25个 DIA 扫描,每个间隔宽度为2 Th,产生38个独特的肽段。在7分钟的方法中,从 m/z 650到700范围,~142ms 获得25次扫描切片,并产生48个独特的肽。结果显示尽管 Q-OT-Astral扫描速度很快,该平台不需要谱平均即可定期提供高质量的肽谱。
在 Orbitrap Astral系统上的7分钟 LC 梯度结果3个重复中,作者报告了来自94,267个肽段的7852个蛋白质,平均具有良好的定量重现;相对标准差值平均低于7%。当使用更长的30分钟梯度,3个重复产生来自234,406个肽段的平均10,411个蛋白,整个蛋白质组的中值序列覆盖率为42.4% 。15分钟和60分钟梯度分别产生来自195,613和254,754个肽段的9831和10,645个蛋白,平均序列覆盖率分别为36.0% 和44.4% ;随着时间的推移发现的累积肽和蛋白质揭示了每个梯度的发现率(图3)。
通过比较 log2(蛋白质无标记定量[ LFQ ])值) ,15,30和60分钟梯度的重复实验产生高度定量重现性。在技术重复之间,对于15分钟,30分钟和60分钟的方法,分别获得0.983,0.990和0.992的 r2值。当比较15分钟和60分钟方法之间的蛋白质 LFQ 时,9820个共享蛋白质组的 r2值为0.976。在3个生物学重复之间监测蛋白质 LFQ 的 RSD,发现增加活性梯度长度显着降低 RSD,从15分钟方法的中位数13.6% 降至30分钟方法的9.9% 和60分钟方法的8.9% (图3)。
作者尝试使用30分钟纳米流方法分析了人 HAP1细胞中线粒体基因 MGME1 CRISPR-Cas9 KO的蛋白质组,结果量化了平均10,353个蛋白。作者还使用相同的样本进行OT-Ascend 61分钟的主动梯度 DIA 方法的结果,结果量化了来自7889(KO)和7860(WT)基因的8010(KO)和7978(WT)蛋白。图4B 显示了由每个 MS 平台测量的7304重叠蛋白测量值的 WT 和 KO 之间的相对倍数变化的比较。总的来说,两个平台结果之间有很强的相关性(r = 0.94)。
Orbitrap Astral平台在30min方法比较 WT 和 KO 样品时检测到449个显着上调或下调的蛋白质;而Orbitrap Ascend 在61分钟单次注射法后检测到380个显著差异的蛋白质,其中61.6% (即234个)与 Orbitrap Astral结果一致(图4C,黄色点)。从这些数据中,作者观察到 Orbitrap Astral对每个定量蛋白质产生的前体测量数量平均超过两倍。我们认为,这是一个关键因素,可能导致轨道天体系统产生更具统计学意义的测量。最后,作者检查了从这两个数据集 GO 富集结果(重叠项以红色显示),观察到每个数据集的前11个术语在两个数据集中共享,除此之外还有高度的重叠。
上图与其他研究对比说明采用 Orbitrap Astral的研究相对于以前的研究已经达到的吞吐量和灵敏度的飞跃,Orbitrap Astral达到的这一里程碑预示着高通量人类蛋白质组学的新时代的到来,以期实现其最终目标,即在一个单一实验中实现对整个蛋白质组的检测。
人类蛋白质组代表了生物学复杂性的巨大障碍,研究人员长期以来一直受到其空间和时间波动,可能出现的许多蛋白质同种型和 PTM 以及人类蛋白质丰度的广泛动态范围的阻碍。这些过程无疑会产生一个极其复杂的蛋白质组,其中每个基因产物可能存在数十或数百种变异——即蛋白形式。因此需要质谱蛋白质组学领域的迅速发展来匹配,这是由更快、更灵敏的仪器、更廉价、更有效、更简便的样品制备方法、新的液相色谱分离技术以及数据处理方面的突破所推动。
本研究对最新出现Orbitrap Astral系统进行测试,展示了其高的覆盖度、高通量和高灵敏度,其并与样品制备、方法开发和数据处理方面的许多令人难以置信的进展配合,正在开创蛋白质组学的新时代。
相关阅读
本文系联川生物公众号原创文章,未经授权禁止转载,侵权必究! 扫描下方二维码 点分享
点点赞
点在看