文章标题：Trilobatin, a Novel Naturally Occurring Food Additive, Ameliorates Alcoholic Liver Disease in Mice: Involvement of Microbiota-Gut-Liver Axis and Yap/Nrf2 Signaling Pathway
发表日期：2024.08
发表期刊：Journal of Agricultural and food chemistry(IF：5.7)
研究机构：遵义医科大学
技术手段：RNA-Seq+16S rDNA测序
酒精性肝病是酒精依赖成瘾和长期过量饮酒所致的一类肝脏疾病，主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、肝硬化和肝癌。迄今，除了长期禁酒外，酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）在药物和干预治疗方面仍面临诸多挑战，深入阐明ALD的病理机制和研发更安全有效的治疗药物具有重要意义。
三叶苷是贵州民族药木姜叶科甜茶的主要活性成分之一，同时，也是天然来源的新食品添加剂。目前，三叶苷已被世界卫生组织和联合国粮农组织食品添加剂联合专家委员会收录，也被美国食用香料与提取物制造者协会列为公认安全物质。该研究发现三叶苷通过激活YAP/Nrf2信号通路并调控肠道菌群稳态发挥抗ALD的作用。本研究有助于阐明三叶苷防治ALD的作用机制，同时提示三叶苷可作为ALD防治的候选或先导化合物。该研究成果得到教育部创新团队及国家自然科学基金等项目支持。
三叶苷（Trilobatin, TLB, 图1A）是一种天然食品添加剂，具有强大的抗氧化应激和抗炎活性，并具备良好的安全性。为了解TLB对ALD的影响，采取Gao-Binge法构建ALD小鼠模型（图1B）。采用配对喂养模式，以确保各组之间的热量摄入相同，使各组之间小鼠的初始体重和最终体重没有显著差异（图1C）。结果显示，EtOH处理组中的小鼠肝指数显著升高，而TLB和水飞蓟素逆转了这种变化（图1D）。此外通过ELISA检测血清中生化指标发现，与对照组相比，TLB和水飞蓟素显著降低了EtOH处理后小鼠血清AST和ALT的含量（图1E-F）。同时，EtOH处理组的血清TG和TC水平显著升高，而TLB和水飞蓟素逆转了这种变化（图1G-H）。此外，EtOH处理后血清VLDL-C和LDL-C水平显著升高，而给予TLB和水飞蓟素的小鼠显著降低以上指标（图1I-J）。以上结果表明TLB和水飞蓟素减轻了EtOH引起的小鼠肝脏病理损伤。此外，HE和油红染色结果表明，暴露于EtOH导致肝细胞排列异常、脂质囊泡在胞质区室中积累以及肝细胞内的炎性浸润。而TLB或水飞蓟素显著改善了肝脏病理改变（图1L）。这些结果表明，TLB减轻了EtOH诱导的ALD小鼠的病理性肝损伤和脂肪变性。
为了进一步探讨TLB对ALD小鼠保护作用的分子机制，我们采用转录组测序分析了对照组、EtOH模型组和EtOH + TLB 40mg/kg组的基因转录情况。结果显示，在EtOH + TLB 40mg/kg组与EtOH模型组中共检测到1895个差异基因（DEGs），在EtOH模型组与对照组中共检测到5488个DEGs（图3A），表明小鼠在EtOH诱导及TLB给药后存在基因表达差异。因此，我们进一步通过火山图对不同组间的差异基因进行可视化。结果显示，与对照组相比，在EtOH模型组有3568个显著上调的DEGs和1920个显著下调的DEGs；而在EtOH + TLB 40mg/kg组和EtOH模型组之间，有513个DEGs显著上调，1382个DEGs显著下调（图3B-C），进一步说明TLB可能通过调控特定基因表达发挥抗ALD的作用。此外，热图显示， TLB 40mg/kg组和对照组中DEGs的表达模式与EtOH模型组有显著差异（图3D）。GO富集和KEGG通路分析揭示了TLB抗ALD作用的信号通路，表明免疫相关途径和生物氧化过程在TLB抗ALD的作用中占据主导地位。此外，氧化磷酸化、NF-κB信号通路和hippo信号通路也参与其中（图3E-F）。值得注意的是，在这些DEGs编码的蛋白质中，存在1362个相互作用对，我们通过Cytoscape的MCODE插件鉴定了主要的PPI网络靶标（图3G）。值得注意的是，YAP信号通路在TLB抗ALD中至少介导了部分肝脏保护作用。
基于前述转录组测序分析结果，可知TLB可能通过调节Hippo信号通路在ALD的进展中发挥重要作用。为进一步验证，我们采用western blot法检测Hippo信号通路的关键靶基因YAP及其下游的信号转导。结果表明，EtOH处理后，total-YAP、nucleus-YAP、TEAD-1、ANKRD1、CYR61、CTGF的蛋白表达显著升高，而p-YAP的蛋白表达降低。经TLB处理后，total-YAP、nucleus-YAP、TEAD-1、ANKRD1、CYR61、CTGF的蛋白表达较EtOH模型组显著降低，而p-YAP蛋白表达显著升高（图4B-J）。此外，我们通过分子对接技术对TLB与YAP的结合情况进行预测，结果表明其对接结合能为−6.65 kcal/ mol，TLB可直接与YAP的ASP 14、VAL 7和HIS 6氨基酸位点相互作用（图4A）。此外，TLB显著提高nucleus-Nrf2的蛋白水平，同时降低Keap1和胞浆中Nrf2的蛋白水平（图4N-K）。同时，TLB显著上调HO-1和NQO-1的蛋白表达（图4O-Q）。不仅如此，EtOH显著增加了NF-κB的磷酸化水平，而TLB则明显降低NF-κB的磷酸化水平（图4R）。这些结果表明，TLB发挥的有效ALD保护作用，至少部分是通过靶向YAP介导的Nrf2/NF-κB信号通路来达到的。寻找YAP和Nrf 2之间的相互作用。（图S1A）YAP-Nrf 2蛋白结合位点相互作用的二维图。（图S1B）Nrf 2和YAP之间结合位点的完整说明。（图S1C-D）使用所示抗体，通过免疫沉淀试验研究肝脏中YAP和Nrf 2之间的相互作用。
采用16S rDNA测序技术，以探讨TLB是否会影响EtOH暴露条件下的肠道微生物群组成。结果表明， EtOH干预后的小鼠肠道微生物群α-多样性（Chao 1和Shannon指数）显著降低，而TLB则逆转了这些变化（图5A-B）。此外，PCoA分析结果表明EtOH模型组小鼠的肠道微生物群组成结构与其他组明显分离，而对照组与TLB组之间没有分别（图5C）。此外，在门水平上，EtOH显著提高了厚壁菌门/拟杆菌门的比例。相比之下，与EtOH模型组相比，TLB显著降低了厚壁菌门/拟杆菌门的比例（图5D）。此外，EtOH显著增加了Proteobacteria、Alloprevotella和Dubosiella的丰度，而Bifidobacteria的丰度减少（（图5E-F）。不仅如此，LDA和LEfSe分析数据显示，与对照组相比，EtOH处理后Proteobacteria和Dubosiella水平升高。而TLB增加了Bifidobacteria水平（图5G-H）。这些发现表明，TLB至少在一定程度上通过恢复肠道微生物群的稳态来预防ALD。
基于以上结果，我们还探讨了TLB对肠上皮屏障的影响。结果表明，与对照组小鼠相比，EtOH模型组小鼠回肠上皮结构损伤。而TLB明显恢复了损伤的肠上皮结构（图5I）。此外，与对照组相比，EtOH暴露显著降低了小鼠回肠中claudin 1、ZO-1和occludin的蛋白表达；然而，WB和IHC结果表明，TLB明显逆转了EtOH损伤后的这些变化（图5J-N）。以上结果表明TLB有效减轻了EtOH引起的肠上皮屏障损伤。
三叶苷通过微生物-肠−肝轴改善ALD的作用机制示意图
总之，作者首次揭示了TLB通过调节YAP/Nrf2途径和“微生物群-肠道-肝脏”轴，以及减少肝脏氧化应激和炎症来预防ALD。
第一作者简介
易杨，遵义医科大学2022级研究生，研究方向为临床药学基础研究、中药药理学，多次获得校级、省级及国家级荣誉。
通讯作者简介
龚其海 教授，主要研究方向为中药神经药理与毒理，先后主持国家重点研发计划“中医药现代化研究”重点专项、国家自然科学基金、教育部等课题或项目20余项，获国家发明专利授权5项，在国内外发表论文200余篇，其中被SCI收录60余篇。
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