RNA表观：RNA结合蛋白课题设计思路-备战国自然2025

核糖核酸（RNA）作为一种重要的遗传信息载体，在生长发育、衰老及疾病等生理、病理过程中都具有重要的作用。随着转录后基因调控在细胞生命过程中的重要性被逐渐发掘，围绕RNA的分子机制研究，尤其是针对RNA-蛋白质之间相互作用的探索，对于解析细胞复杂的动态变化越来越关键^[1]。作为细胞中一类能够结合RNA的特定蛋白质，RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）完整地参与了RNA的生命周期，对细胞生理过程的运行及机体稳态的维持具有关键性的作用^[2]。研究RNA结合蛋白质组，可以为发掘生物标志物、寻找疾病治疗的靶标提供重要信息。从上世纪70年代起，就有学者发展研究RBP与RNA相互作用的工具^[3-5]，以期揭示其结构与功能特性。近年来，捕捉RBPs的手段推陈出新，研究覆盖面逐渐从mRNA的结合蛋白，延伸至非编码RNA如rRNA、tRNA的结合蛋白。交联方式也从单纯的紫外光交联发展至与荧光、点击化学、化学交联、邻近标记等多方式联用的标记富集方法。

引自：RNA-Binding Proteome Analysis and Functional Explorations^[6].

RNA结合蛋白（RBP）研究可以利用多种技术来探索蛋白质-RNA相互作用的机制和功能。以下是一些常用的研究方法和思路：

1、RIP-seq (RNA Immunoprecipitation Sequencing)（有目标蛋白，检测与目标蛋白结合的RNA有哪些）

利用特定的抗体捕获与目标RBP结合的RNA分子。通过高通量测序技术对RNA进行测序和分析。这种方法可以帮助鉴定与特定RBP相互作用的RNA分子，进而分析这些相互作用的生物学意义。

（详见：超详细RIP实验流程，看完神清气爽）

RIP-seq技术流程

2、CLIP-seq (Crosslinking and Immunoprecipitation Sequencing)（有目标蛋白，检测与目标蛋白结合的RNA有哪些）

通过紫外线或化学交联剂使RBP与其结合的RNA形成稳定的复合物。使用特定抗体免疫沉淀这些复合物，然后进行高通量测序。CLIP-seq可以提供关于RBP与RNA结合位点的详细信息。

CLIP-seq技术流程

3、RNA Pull-Down（有目标RNA，检测与目标RNA结合的蛋白有哪些）

使用生物素标记的RNA探针作为“诱饵”，捕获与之特异性结合的RBP。通过亲和层析技术（如链霉亲和素-琼脂糖珠）纯化与RNA探针结合的蛋白质。最后通过Western Blot或质谱等方法验证这些蛋白。

RNA pull-down技术流程

4、RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (RNA-EMSA)（有目标RNA，检测目标RNA结合的RBP蛋白）

用于研究蛋白质与RNA结合的实验室技术。蛋白质与RNA结合后形成的复合物在凝胶中的迁移速率会比单独的RNA分子慢。通过电泳和检测结果判断蛋白质是否与RNA发生了结合。

RNA-EMSA技术流程

5、RNA与蛋白共定位（IF-FISH）（研究目标RNA和目标蛋白在细胞或组织中的空间关系）

通过原位杂交及免疫荧光双染，可以在组织细胞中对核酸分子和蛋白指标同时进行共定位、以及定性分析，可以用来从共定位角度提示核酸和蛋白存在相互作用。

IF-FISH技术流程

除了上述技术外，近期也有许多其他新技术一个个被开发和应用起来，如用于微量高分辨率RNA结合蛋白位点检测的ARTR-seq技术（详见：https://mp.weixin.qq.com/s/ycYNw_0_Ycw2mpqMhrjlpw）。这些方法各有优势和局限，选择合适的方法取决于研究的具体目标和所需分辨率。通过这些技术的结合使用，可以从多个维度揭示RBP与RNA的相互作用机制，为理解RBP在生物学过程中的功能提供有力支持。

在癌症细胞中，着丝粒（centromere）的完整性对细胞分裂和遗传物质的稳定至关重要。研究表明，着丝粒RNA（cenRNA）在着丝粒的结构和功能中扮演着重要角色，尤其是与着丝粒相关的蛋白质，如CENPA。CENPA是一种特殊的组蛋白，负责维持着丝粒的结构完整性。在癌细胞中，m⁶A修饰是一种常见的RNA表观遗传修饰，其在调控基因表达、RNA稳定性和细胞功能中起着重要作用。然而，目前对m⁶A修饰在cenRNA及其与CENPA相互作用中的具体作用仍缺乏深入了解。2024年9月18日，北京大学刘君团队发表在Cell上题为m⁶A-modified cenRNA stabilizes CENPA to ensure centromere integrity in cancer cells的研究旨在探讨m⁶A修饰的cenRNA如何稳定CENPA，从而确保癌细胞的着丝粒完整性。

1、癌症细胞中cenRNA上的m⁶A修饰水平升高

研究发现，在癌症细胞中，与非癌症细胞相比，中心粒RNA（cenRNA）上的m⁶A修饰水平显著升高。通过m⁶A-RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）数据的综合分析，研究者比较了五种癌症细胞（A375、HEC-1-A、HepG2、K562和MCF7）和两种正常细胞类型（IMR90和HEK293T）中不同RNA物种的甲基化水平。结果表明，非编码RNA（ncRNAs）显示出比编码RNA更高的m⁶A甲基化水平，尤其是在癌症细胞中。

图1 m⁶A修饰的cenRNA促进着丝粒稳定性

2、CENPA与m⁶A修饰的cenRNA相互作用，确保了中心粒的完整性

研究确定了CENPA（一种H3变体）作为cenRNA的m⁶A阅读器。CENPA在中心粒上定位，并在有丝分裂期间保持中心粒的完整性和功能中起着至关重要的作用。m⁶A修饰的cenRNA在S期稳定了癌症细胞中CENPA的中心粒定位。CENPA在Leu61和Arg63的突变或去除cenRNA m⁶A修饰会导致S期中心粒结合的CENPA丢失，进而影响中心粒的完整性，导致异常染色体分离，阻碍癌症细胞增殖和肿瘤生长。

图2 cenRNA甲基化稳定S期CENPA的维持

3、CENPA与m⁶A-cenRNA相互作用的破坏会损害癌症细胞的中心粒完整性

通过CRISPR-dCas13b-FTO系统特异性靶向cenRNA的m⁶A修饰，研究发现这种靶向导致染色体易位和中心粒断裂的频率显著增加。此外，通过METTL3（m⁶A修饰的关键酶）的敲低或dCas13b-FTO处理，研究者观察到CENPA在中心粒的结合显著减少，这进一步证实了cenRNA甲基化在维持中心粒稳定性中的作用。

图3 CENPA优先与m⁶A修饰的cenRNA结合

4、CENPA通过其N端的两个关键氨基酸残基Leu61和Arg63与m⁶A修饰的cenRNA结合

通过一系列的实验，包括电泳迁移率分析（EMSA）、图形化液体细胞透射电子显微镜（GLC-TEM）和分子对接实验，研究者揭示了CENPA与m⁶A修饰的cenRNA之间的直接相互作用，并确定了CENPA中负责这一相互作用的两个关键氨基酸残基。

图4 破坏CENPA-m⁶A cenRNA相互作用导致染色体不稳定和细胞周期缺陷

5、破坏CENPA与m⁶A-cenRNA的相互作用会导致癌症细胞的染色体不稳定性和细胞周期缺陷

研究结果表明，通过破坏CENPA与m⁶A修饰的cenRNA之间的相互作用，可以增加癌症细胞的基因组不稳定性，导致细胞周期缺陷，减少细胞增殖，并抑制肿瘤生长。此外，这种相互作用的破坏还增强了针对中心粒活性的药物的细胞毒性，表明这种策略可能与特定针对中心粒完整性的药物联合使用，以克服药物抗性。

图5 CENPA与m⁶A修饰cenRNA之间的相互作用促进肿瘤生长

本研究揭示了m⁶A修饰的cenRNA通过稳定CENPA在癌细胞中的重要机制，强调了着丝粒在癌症生物学中的关键作用。这一发现为理解癌细胞如何通过调控RNA修饰来维持着丝粒的完整性提供了新的视角，同时也为未来的癌症治疗策略提供了潜在的靶点，特别是在针对RNA修饰和着丝粒功能的干预措施方面。这些发现也揭示了CENPA作为m⁶A阅读器的新角色，并为癌症治疗提供了潜在的新靶点。

参考文献

[1] Licatalosi, D. D.; Darnell, R. B., Nat. Rev. Genet. 2010, 11 (1), 75-87.

[2] Lukong, K. E.; Chang, K.-w.; Khandjian, E. W.; Richard, S., Trends Genet. 2008, 24 (8), 416-425.

[3] Wetzel, R.; Soöll, D., Nucleic Acids Res. 1977, 4 (5), 1681-1694.

[4] Greenberg, J. R., Nucleic Acids Res. 1979, 6 (2), 715-732.

[5] Brimacombe, R.; Stiege, W.; Kyriatsoulis, A.; Maly, P., Intra-RNA and RNA—protein cross-linking techniques in Escherichia coli ribosomes. In Methods Enzymol., Academic Press: 1988; Vol. 164, pp 287-309.

[6] Ruxin Zeng, Peng R. Chen. RNA-Binding Proteome Analysis and Functional Explorations[J]. Acta Chimica Sinica, 2024, 82(1): 53-61.

[7] Kang Z, Li R, Liu C, et al. m⁶A-modified cenRNA stabilizes CENPA to ensure centromere integrity in cancer cells. Cell. 2024;187(21):6035-6054.e27.