解码酱油冬季发酵过程中温度驱动的微生物群落变化及风味调节机制

企业   2024-12-23 17:03   浙江  




英文标题:Decoding temperature-driven microbial community changes and flavor regulation mechanism during winter fermentation of soy sauce

发表期刊:Food Research International

发表时间:2024年2月

研究机构:华南理工大学食品科学与工程学院

涉及组学:扩增子测序、宏基因组测序





摘要

冬季发酵酱油的风味调节是业界面临的一个紧迫挑战,而发酵温度被认为是强化酱油风味的有效方法。为此,设计了30℃控温(SSCT)和冬季常温(SSRT)工业水平的发酵体系,以阐明酱油温控增味的分子基础和微生物调控机制。感官评价表明,30°C发酵增强了焦糖、花香、水果、烤坚果和烟熏香气。共鉴定出160种挥发物,对其中39种进行了气味活性值(OAV)评价。确定了11种挥发物作为区分SSRT和SSCT香气特征的气味标记物,其中2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(HDMF,焦糖样)、β-达马酮(花香)、2-甲基丙酸乙酯(果味)、乙酸乙酯(果味)和2- 3-甲基-1-丁醇(麦芽味,酒精味)对SSRT和SSCT的风味增强起主要作用。此外,高通量测序结果显示,温度干预诱导的细菌结构差异(R = 0.324, P = 0.001)大于真菌结构差异(R = 0.069, P = 0.058)。相关分析表明,优势属和低丰度属共同驱动了菌株挥发谱的形成和变异,其中以WeissellaTetragenococcusStarmerellaPediococcus最为显著。重点阐述了关键香气物质HDMF和5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)的形成途径。温度介导的非生物反应和微生物群的基因功能都有利于HDMF和HEMF的C5前体的产量,而Zygosaccharomyces和乙醛不足限制了HEMF通过生物合成途径的水平提升。本研究为酱油发酵温度控制的工业应用提供了实践和理论依据。


感官评价

选取了9种特色的酱油气味进行感官评价:酸味、烟熏味、烤坚果味、麦芽味、果味、花香、熟土豆味和焦糖味。与SSRT相比,SSCT获得了更丰富的香气特征,焦糖、花香、水果、烤坚果和烟熏香气更强,酒精、酸和熟土豆香气略高,麦芽香气较弱。值得注意的是,所有小组成员都确定了SSCT对花香、水果味、烤坚果味和烟熏味的感官知觉,SSCT的得分分别比SSRT高15.43%、25.26%、26.93%和15.78%。Liang等(2019)的实际工作也证实,30℃恒温发酵强化了酱油产品的果味和烟熏香气强度。综上所述,30℃调温发酵可以改善冬季常规发酵酱油的感官特性。


代谢物谱分析

通过HS-SPME-GC-MS和DLLME-GC-MS在SSRT和SSCT中共鉴定出160种化合物,包括14种酸类、18种醇类、18种醛类、35种酯类、24种呋喃类、3种杂环类、25种酮类、11种酚类、6种吡嘧啶类和6种含硫化合物。挥发性化合物的含量随着发酵过程的进行而变化,大部分化合物逐渐积累,从而形成最终产品的香气特征。此外,SSCT中醇类、酯类等化合物含量较SSRT丰富,说明冬季温控发酵可以促进挥发性物质的产生。在之前的研究中(Feng et al., 2015),作者筛选了39种挥发性化合物进行定量分析,这些挥发性化合物在分子水平上被鉴定为HLFSS的关键芳香活性化合物。将所选化合物根据其气味质量分为9组,计算每组的累积OAV。24种化合物在SSRT和SSCT中均含有OAVs >1,并被确定为芳香活性成分。花型组、果型组、烤坚果组、焦糖型组和酸型组的累积OAV分别比SSRT高44.51%、53.89%、44.37%、21.23%和12.90%,而麦芽型组的累积OAV略高于SSCT。这些结果与相应的感官评价一致。然而,烟熏和熟土豆的总OAV强度与其感官评分不一致。这可能是由于未完全检测到潜在的芳香活性贡献者,或者是化合物中的感知相互作用。


SSRT和SSCT香气活性标志物的筛选

利用OPLS-DA模型进行判别分析,从挥发性代谢物数据集中提取特征风味信息,区分发酵终点SSRT和SSCT的代谢物谱。OPLS-DA模型的R2Y和Q2值分别在0.9和0.5以上,说明变量解释和预测能力合理。SSRT和SSCT之间的化学成分被69种挥发性化合物区分,其可变重要投影(VIP)大于1.0。值得注意的是,SSCT有55种代谢物的相对含量更丰富,主要包括17种酯类、10种酮类、9种呋喃类、8种醇类等,而SSRT只有14种代谢物的相对含量更高。将OPLS-DA分析结果与定量分析结果相结合,进一步准确测定挥发性风味代谢物。如图2B所示,VIP >和OAV >属性共有11种挥发性化合物,被认为是区分SSRT和SSCT香气谱的重要标记。其中,HDMF(焦糖样)、β-damascenone(花型)、2/3-甲基-1-丁醇(麦芽型、酒精型)、2-甲基丁酸(酸型)、2-甲基丁醇(麦芽型)、乙酸乙酯(果味)和2-甲基丙酸乙酯(果味)在SSCT中较高,其余4种化合物在SSRT中较高。在这些重要的差异标记中,HDMF具有最高的焦糖样OAV,差异显著(在SSRT中为293.91,在SSCT中为398.55),可能导致SSCT中焦糖样香气强度的增强。HDMF通常被认为是酱油中关键的焦糖类呋喃酮,可以通过美拉德反应或微生物代谢产生。SSCT中较浓的焦糖样香气可能与30℃长时间发酵有关,这可能有利于减缓美拉德反应和微生物合成生产HDMF。此外,花香气的感官差异较大可能主要归因于β-大马酮的OAV差异明显,β-大马酮是各种食物中重要的花成分,该化合物的OAV在SSCT中升高了200以上。对于吡嗪类,2,3,5-三甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪与烘果香气的OAV均小于1,因此不是样品间烘果香气差异的主要原因。然而,SSCT的烘焙坚果香气感官评分提高了26.93%。因此,作者假设存在其他潜在的烘焙坚果风味,如2-异丁基-3-甲基吡嗪和2-异戊基-6-甲基吡嗪,这些风味之前被描述为酱油中的烘焙坚果香气,其含量存在显著差异。对于醇类和酸类,2- 3-甲基-1-丁醇和2-甲基丁酸的OAV强度在SSCR中得到提高,其中2- 3-甲基-1-丁醇的总OAV比SSRT高200以上。相比之下,SSRT中3-甲基丁醛的OAV比SSCT高200以上,这是SSRT具有更强麦芽香气的关键。2 - 3-甲基丁醇是由支链氨基酸通过Strecker降解或微生物作用产生的,在发酵过程中微生物通过埃利希途径转化为相应的醇类(2 - 3-甲基-1-丁醇)和酸类(2 - 3-甲基丁酸)。同样,熟马铃薯气味剂3-(甲基硫)丙醇可以形成3-(甲基硫)丙醇,其在SSRT中的OAV比SSCT高100以上。这些醇和酸在SSCT中更丰富的积累可能表明,在30°C的温度控制下,通过相应醛的转化促进了它们的形成。在酯类标记上,乙酸乙酯和2-甲基丙酸乙酯可能是SSCT果实香气较强的鉴别性化合物。在SSCT中,它们的总OAV增加了约100。乙酯主要通过微生物代谢乙醇和酸之间的酯化反应生成。因此,有理由推测30℃的温度控制促进了微生物的代谢活性,加速了酯类的合成。综上所述,30℃控温发酵可调节温度介导的微生物代谢和非酶反应,是提高工业酱油风味品质的有效策略。


微生物群落分析

扩增子测序用于澄清SSRT和SSCT发酵过程中的微生物群。真菌群落多样性随着时间的推移而增加,SSRT的Chao1和Shannon指数均高于SSCT,表明SSRT中真菌发酵生态系统相对丰富。值得注意的是,SSRT和SSCT的细菌群落多样性变化趋势不同。SSCT的Chao1和Shannon指数随发酵时间的延长而下降,但SSRT有明显的波动。这可能是由于发酵温度的变化对细菌α多样性的影响大于对真菌的影响。通过PCA分析来描述beta多样性,并比较SSRT和SSCT之间的群落结构差异。SSRT和SSCT组的细菌群落在PC2轴上有明显的分化,而真菌群落没有明显的分离。ANOSIM结果显示,SSRT组与SSCT组之间的细菌群落差异大于组内差异(R = 0.324, P = 0.001),真菌群落差异也大于组内差异(R = 0.069, P = 0.058)。与α多样性相似,发酵温度对细菌β多样性的影响更大。共注释了93个细菌OTU和242个真菌OTU。所标注的OTU分别属于61个和119个不同的细菌和真菌属。然后,测定了SSRT和SSCT在属水平上的微生物群落演替的时间格局。对于细菌来说,WeissellaTetragenococcusStaphylococcusLeuconostocLactococcusStreptococcus是SSRT和SSCT群落的优势属。Weissella在发酵初期占优势(分别为30.10%和51.97%),在第三阶段后迅速下降至10%以下。相反,随着发酵的进行,Tetragenococcus的数量急剧增加,并在第三阶段后成为优势菌群,占总菌群的40%以上。SSRT和SSCT群落中葡萄球菌Staphylococcus在整个发酵过程中均为优势属,其相对丰度逐渐增加,在发酵第III期达到峰值(分别为75.01%和33.98%),发酵结束时下降到20%以下。LeuconostocLactococcusStreptococcus的丰度总体上随发酵时间的变化而波动。真菌群落结构相对简单。在发酵过程中,Aspergillus在真菌群落中占有很大的优势,特别是在SSCT组,Aspergillus丰度超过95%,这是因为使用了米曲霉发酵剂。在SSRT组中,除Aspergillus外,ZygosaccharomycesStarmerellaCandida为优势属,ZygosaccharomycesStarmerella的相对丰度从0.06% ~ 0.13%(第III阶段)急剧上升到11.53% ~ 13.59%(第IV阶段),发酵结束后显著下降。


SSRT和SSCT发酵潜在核心菌群分析

SSRT和SSCT发酵中潜在的核心微生物群是基于三个标准来探索的:(i)稳定分布在至少20%的样品中,(ii)相对丰度大于0.1%,(iii)与挥发性风味显著相关。对各组微生物属进行覆盖度(>20%)和相对丰度(>0.1%)筛选后,SSRT组获得22属(11种细菌,11种真菌),SSCT组获得17属(15种细菌,2种真菌)。计算Spearman相关系数,确定这些属与挥发性风味之间存在显著相关(P < 0.05, |ρ| > 0.6)。在SSRT组中,WeissellaTetragenococcusStarmerellaMortierellaCladosporium与70种化合物显著相关,其中包括16种芳香活性化合物。在SSCT组中,WeissellaTetragenococcusLactococcusMacrococcusPediococcus与含有15种芳香活性化合物的78种化合物密切相关。收集了不同来源的酱油样品,以探索核心功能微生物群,发现WeissellaTetragenococcusLactococcusPediococcus是这些属中产生风味的微生物。因此,核心微生物组成和丰度的变化可能是SSRT和SSCT组之间不同代谢谱的主要原因。Weissella和Tetragenococcus在酱油发酵过程中起着重要的风味发育作用,是各组中占优势的核心细菌。这两种细菌都与40多种挥发性香料高度相关,并贡献了多种芳香活性标记,如2-甲基丁酸、3-甲基-1-丁醇、HDMF和β-大马酮。Starmerella是酱油发酵中的优势真菌属。该属是SSRT的优势核心微生物,与19种化合物具有显著的相关性,其中含有3种芳香活性物质麦芽糖醇、HDMF和2-甲基丁酸。这表明Starmerella对SSRT风味形成的潜在重要性。总之,核心优势属通过其自身的相对丰度对代谢谱的变化做出了实质性的贡献。然而,一些优势类群可能没有突出的风味化合物生产力。例如,在SSRT和SSCT发酵过程中,葡萄球菌是优势微生物,但与挥发物没有表现出丰富的相关性。值得注意的是,两组的挥发性化合物不仅与优势属密切相关,而且与低丰度属密切相关,低于1%。在SSRT群落中,低丰度真菌Mortierella(0.23%)和Cladosporium(0.30%)与47种化合物具有较强的相关性,贡献了3种芳香活性物质。在SSCT群落中,低丰度细菌Macrococcus(0.68%)和Pediococcus(0.23%)与58种化合物呈显著相关,贡献了7种香气活性标记。这些发现表明,这些低丰度的微生物可能对所观察到的代谢物谱的发育和变化负有很大的责任。


温度介质对HDMF和HEMF形成的影响

呋喃酮HDMF和HEMF因其诱人的感官特性在风味分析领域备受关注。研究结果表明,这两种呋喃酮都是HLFSS中关键的焦糖样贡献者,将温度控制在30°C可以提高它们的产量,HDMF是一个重要的区分标记。然而,HDMF和HEMF的形成途径在KEGG数据库中缺乏明确的示意图,在酱油发酵中也没有系统的报道。因此,作者在前人研究的基础上进一步构建了它们的合成途径,并通过宏基因组功能注释探索温度介导发酵对HDMF和HEMF形成的影响。HDMF的合成涉及EMP,在EMP途径中,d -果糖可以分别通过己糖激酶(EC 2.7.1.1/EC 2.7.1.4)和6-磷酸果糖激酶1 (EC 2.7.1.11)转化为d -果糖-6-磷酸和d -果糖-1,6-二磷酸(FBP)。随后,HDMF通过化学方法或Zygosaccharomyces rouxii生物合成从FBP生成。值得注意的是,HDMF化学生成的最佳温度为30°C,这可以推断,30°C的控温发酵有利于FBP向HDMF的化学转化。此外,与d -葡萄糖-6-磷酸与d -果糖-6-磷酸转化相关的编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)基因在SSCT群落中丰度丰富。这可能会促进d -果糖-6-磷酸的形成,而d -果糖-6-磷酸已被证实可以通过Zygosaccharomyces rouxii转化为HDMF。然而,在SSCT群落中存在的Zygosaccharomyces种群规模较小(平均丰度为0.15%),可能在一定程度上限制了HDMF的生物合成。HDMF也可以通过酱油体系中的美拉德反应生成。其形成机理是戊糖或己糖的Amadori化合物经2.3烯醇化分解,分别生成c5 -1-脱氧二酮糖和c6 -1-脱氧二酮糖(Blank & Fay, 1996)。1-脱氧二酮糖的进一步化学转化然后通过可能的中间体2,5-二甲基-2,4-二羟基-3(5H)-呋喃酮(乙酰福尔摩因)产生HDMF。在长期发酵过程中,将温度控制在30℃可能有利于减缓美拉德反应,从而促进HDMF在SSCT中的积累。综上所示,SSCT中HDMF的高产量很可能依赖于FBP的温度介导的化学转化和长时间的美拉德反应,而不是Zygosaccharomyces rouxii的生物合成。


结语

以上就是本次文献解读分享,在这里我们了解到发酵温度控制在30℃可以改善冬季发酵HLFSS的香气品质,表现为花香、果香、烘果香和烟熏香增强。HDMF、β-大马酮、2-3-甲基-1-丁醇、2-甲基丙酸乙酯和乙酸乙酯是SSCT香气增强的主要因素,这与温度干预引起的微生物动态模式差异有关,尤其是细菌群落。SSCT群落以WeissellaTetragenococcusLactococcusMacrococcus核心属较为丰富,SSRT群落以StarmerellaMortierellaCladosporium核心属较为丰富。这些属是产生风味的主要贡献者,与挥发性化合物有很强的相关性。SSCT中较高的功能基因丰度和有利的非酶反应条件可以提高HEMF的HDMF和C5前体的产量(P < 0.05),而Zygosaccharomyces的低丰度群落和乙醛不足限制了HEMF通过生物合成途径的增加。未来如何通过人工控温与构建合成核心菌群相结合,进一步改善冬季酱油的发酵调节,以获得更好的风味,值得我们去探索。


相关阅读


Cell:2500个食物宏基因组中未被探索的巨大微生物多样性及其与人类微生物组的联系
【联川苍穹-宏基因组云分析】玩转beta多样性分析
微生物-线虫协同进化?宏基因组+RNA-Seq揭秘线虫进化的"达芬奇密码”|环境微生物




本文系联川生物公众号原创文章,未经授权禁止转载,侵权必究!

扫描下方二维码





点分享


点点赞


点在看


联川生物
一个提供科研入门学习资源、经验的平台。 分享前沿测序技术资讯、实用生信绘图技巧及工具。 发布高质量的科研论文精度、精炼科研思路。 我们的目标是持续提供“干货”,滋润您的科研生涯。
 最新文章