宏基因组分析揭示了微生物群落在红曲米醋发酵过程中游离氨基酸生物合成中的代谢作用

英文标题：Metagenomicanalysis revealing the metabolic role of microbial communities  in the free amino acid biosynthesis of Monascus rice vinegar during fermentation

发表期刊：Food Science and Human Wellness

发表时间：2024年2月

研究机构：北京食品科学研究院

涉及组学：宏基因组测序

    对红曲米醋生产过程中的总酸度、氨基酸氮、还原糖、可溶性无盐固形物等指标进行了监测。如图所示，醋酸发酵过程中总酸度迅速升高，在V2阶段达到3.092 g/100 mL。之后，总酸的积累速度有所减缓，但仍呈上升趋势。最后一天的总酸度为4.534 g/100 mL，V1-V3阶段氨基酸氮、还原糖和可溶性无盐固形物含量均有所增加，分别从0.034 g/100 mL增加到0.286 g/100 mL，从0.870 g/100 mL增加到2.033 g/100 mL，从2.284 g/100 mL增加到6.071 g/100 mL。其中还原糖和可溶性无盐固形物在V2阶段增长缓慢，而在V3阶段增长迅速。这种现象可能是由于分解原料的微生物快速生长，导致碳水化合物和蛋白质的降解，还原糖、氨基酸氮和可溶性无盐固体的积累。在V4阶段，这些指标略有降低，可能是因为它们在反应过程中被部分消耗，也可能是由于微生物群落的变化，尤其是醋酸菌的变化。有机酸是一种重要的风味物质，其种类和含量各不相同，构成了食醋的独特风味。醋酸和乳酸是醋的重要组成部分，占有机酸总量的65%以上。因此，对乙酸和乳酸的含量进行监测，结果如图所示。乙酸含量从初始值342.605 mg/100 mL迅速上升到发酵结束时的峰值2 854.502 mg/100 mL。乳酸含量在整个发酵过程中呈下降趋势，由V1期的1 841.422 mg/100 mL降至发酵末期的797.795 mg/100 mL。发酵过程中乙酸和乳酸含量的变化与前人的研究结果一致。

  
    醋中的FAA参与美拉德反应，并通过其他生化反应形成香气成分[11]。图2为不同发酵时期FAA含量的变化情况。发酵末期变化最大，为897.382 mg/100 mL，高于V1期（114.294 mg/100 mL）。18种FAAs中，谷氨酸、丙氨酸、精氨酸和亮氨酸含量较高，约占发酵过程中总FAAs的50%。谷氨酸是一种类似谷氨酸钠的底物，它给醋带来鲜味和咸味。谷氨酸具有抗氧化特性。亮氨酸是一种疏水氨基酸，因此具有清除自由基的能力。发酵过程中羟脯氨酸浓度变化不大，保持在较低水平。半胱氨酸从V1期到V4期略有下降，在V4期达到1.535 mg/100 mL的最低值。发酵过程中，除这两种FAAs外，其余FAAs浓度均呈稳定上升趋势。

    在该研究中，红曲米醋发酵过程中存在5个细菌门和3个真菌门，丰度≥0.01%（图3A和B）。其他门也被检测到，但含量较低。优势门为Firmicutes、Proteobacteria、Ascomycota、Basidiomycota和Mucoromycota。发酵开始时，Firmicutes和Proteobacteria的相对丰度分别为79.37%和20.51%。Proteobacteria的相对丰度在V3期迅速上升至57.94%，并一直保持优势（57.9%），直至发酵结束。同时，Firmicutes的丰度下降到41.24%（图3A）。V1期fungal以Ascomycota（82.35%）为主。随着发酵时间的延长，Ascomycota相对丰度降至71.04%，Basidiomycota和Mucoromycota的相对丰度在V4期分别上升至17.63%和11.04%。属水平的分类分析发现28个属，丰度≥0.1%。红曲米醋发酵过程中有7个细菌属（Lactobacillus,Acetobacter,
Clostridium,Enterobacter, Leuconostoc,Klebsiella,Pediococcus）和7个真菌属（Saccharomyces,Lichtheimia, Pichia,Aspergillus,Monascus.Byssochlamys, Wickerhamomyces）占优势。在不同的发酵阶段，这些属的群落组成也有很大的差异。根据微生物属级别的聚类分析，发酵过程中可以将样品分为两种类型：V1和V2为一类，V3和V4为另一类,这两类样品在微生物群落组成上存在显著差异。

 
    “代谢”途径相对丰度最高，从V1期的74.99%增加到V4期的75.92%。每一类都可以分成几个小类。如图所示，碳水化合物代谢和氨基酸代谢占据了主要途径，碳水化合物是细胞结构的主要组成部分和供能物质，调节细胞的生命活动，为其他代谢提供物质基础。因此，碳水化合物代谢在代谢类中占第二高的比例。红曲米醋发酵过程中FAAs含量丰富，其含量与10年陈酿的镇江香醋相似。这些结果表明参与氨基酸代谢的基因是活跃的，KEGG注释结果也证实了这一点。微生物群，尤其是优势菌群，在发酵过程中主要与多种代谢途径相关。可以确定活跃类群（属水平）和代谢途径之间的明确贡献。发现14个优势细菌和真菌分类群的丰度与相同的两个最丰富的途径相关。两个细菌属（Lactobacillus和Acetobacter）和一个真菌属（Saccharomyces）的主要贡献是碳水化合物和氨基酸的代谢活动。Lactobacillus和Acetobacter对碳水化合物代谢途径的贡献分别为43.12% - 73.75%和10.60% - 45.54%，对氨基酸代谢途径的贡献分别为29.28% - 69.21%和15.44% - 61.63%。Saccharomyces对碳水化合物代谢途径（72.29% - 88.58%）和氨基酸代谢途径（73.38% - 88.28%）的高贡献可能是由于其在真菌群落中的丰度较高或适应性强。因此，Lactobacillus、Acetobacter和Saccharomyces可能显示出利用底物参与红曲米醋发酵的能力，这是由于它们的多种代谢。代谢途径贡献的变化与细菌和真菌群落的动态一致。在发酵过程中，微生物群落产生的酶被运输到发酵底物上，驱动发酵过程，这可能是它们的贡献与微生物动力学一致的原因。

    通过将结果与KEGG数据库进行比对，获得了注释的代谢途径和酶谱。根据绘制结果，构建了红曲米醋发酵过程中原料降解和FAA生物合成的预测代谢网络，如图所示。发酵红曲米醋的原料包括大米、麦麸和稻壳，它们都富含淀粉和纤维素，是FAA生物合成的主要底物。结果表明，FAA的生物合成与碳水化合物和氨基酸代谢有关。α-d-葡萄糖-1P是FAA生物合成所需的初始化合物，由淀粉和纤维素通过碳水化合物代谢（ko00500途径）产生。然后它被分解成乙酰辅酶a和丙酮酸，这是FAA生物合成代谢网络中的中心化合物。乙酰辅酶a通过ko00020途径参与TCA循环，TCA循环生成草酰乙酸和2-氧-戊二酸盐。通过氨基酸代谢（ko00250、ko00220和ko00330），2-氧-戊二酸进一步转化为谷氨酸、脯氨酸和精氨酸。此外，草酰乙酸还通过ko00250途径转化为l -天冬氨酸。丙酮酸是通过氨基酸代谢形成l -缬氨酸、l -亮氨酸、l -异亮氨酸、l -丙氨酸和l -赖氨酸的另一个重要中间体（ko00290、ko00250、ko00650和ko00620）。α-d-葡萄糖-1P通过碳水化合物代谢（ko00030）和氨基酸代谢（ko00340、ko00260和ko00270）产生组氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等多种FAAs，这些FAAs也可以相互转化。α-d-葡萄糖- 1P通过碳水化合物代谢（ko00010）生成α-d-葡萄糖-6P，再通过氨基酸代谢（ko00400）转化为苯丙氨酸和酪氨酸。由图可知，淀粉和纤维素的降解与碳水化合物代谢有关，通过ko00010、ko00620和ko00650途径，即生物合成乙醇、丁酸盐、2-乙托因和2,3-丁二醇。其中，乙醇是生产乙酸的主要底物。其他化合物充当了味道的前体。综上所述，通过对红曲米醋发酵过程中功能基因的注释，可以得出碳水化合物代谢和氨基酸代谢在FAA生物合成中起关键作用的结论。

    根据关键酶基因丰度和微生物类群丰度评价红曲米醋发酵过程中微生物群落对FAA合成的贡献。微生物与FAA生物合成途径相关酶的关系如图所示。结果表明，优势菌与FAA的产生关系最为密切。虽然在优势真菌中发现了一些酶，但相关酶的丰度很低。19种关键酶参与了底物降解。其中，β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）在纤维素降解中丰度最高，α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）在淀粉降解中丰度最高。Lactobacillus、Clostridium、Klebsiella、Leuconostoc、Pediococcus和Saccharomyces是底物降解和代谢的主要贡献者。Acetobacter和Clostridium是L-天冬氨酸生成L-丙氨酸的主要贡献者。Acetobacter, Lactobacillus,Saccharomyces,Clostridium,Enterobacter,Leuconostoc, Klebsiella和Lichtheimia对氨基酸合成精氨酸和脯氨酸的贡献最大。L-赖氨酸主要由Acetobacter, Lactobacillus,Clostridium, Enterobacter和Leuconostoc合成。此外，Acetobacter,Lactobacillus,Clostridium,and Saccharomyces也参与苯丙氨酸和酪氨酸的合成。