单细胞测序+表观组学课题设计思路-备战国自然2025

    单细胞测序技术发展如火如荼，很多研究都享受到了单细胞测序技术本身的第一波技术红利。随后出现大量的单细胞图谱研究，包括泛癌免疫细胞图谱、发育细胞图谱乃至各种疾病的全细胞图谱等。单细胞测序研究随后迅速迭代，从“大”图谱即对所有细胞亚群进行鉴定，进化到“小”图谱即对特定的细胞亚型进行精细化研究。如CAF细胞、TAM细胞、NK T细胞、内皮细胞等。

目前单细胞测序研究已经进化到，需要对具体的某一类细胞亚群的生物学故事提出了新的要求。如某类经典通路或代谢调控机制。联川生物先前已经有诸多的单细胞+表观组学的客户案例，包括大热的m6A修饰、组蛋白修饰以及转录因子，具体案例包括—— 

案例1：单细胞+CUT&Tag揭示乙酰辅酶A代谢影响T细胞耗竭^[1]

论文标题：Nutrient-driven histone code determines exhausted CD8+ T cell fates

刊登日期：2024年12月

发表杂志：Science

影响因子：44.7

研究机构：Salk Institute

涉及组学：单细胞转录组、ChIP-seq、CUT&Tag等

    本研究表明，TEX细胞通过下调乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2），同时维持ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）的活性，从乙酸盐代谢转变为柠檬酸盐代谢。这种代谢转换增加了由组蛋白乙酰转移酶KAT2A-ACLY相互作用介导的、在TEX特征基因处的柠檬酸盐依赖性组蛋白乙酰化，同时减少了由p300-ACSS2复合物介导的、在效应T细胞和记忆T细胞基因上由乙酸盐依赖性介导的组蛋白乙酰化修饰。细胞核内的ACSS2过表达或ACLY的抑制可阻止TEX分化并增强肿瘤特异性T细胞反应。这个提示了在细胞不同部位如细胞核或者细胞质中，代谢物所发挥的不同作用。这些发现揭示了一种由营养物质决定的组蛋白密码，其调控CD8+T细胞的分化，对基于代谢和表观遗传的T细胞疗法具有重要意义。

    扩展阅读：大道至简！Science：单细胞+CUT&Tag揭示乙酰辅酶A代谢影响T细胞耗竭

案例2：克隆造血的表观遗传调控因子在免疫治疗期间控制CD8 T细胞的干细胞性^[2]

英文标题：Epigenetic regulators of clonal hematopoiesis control CD8 T cell stemness during immunotherapy

发表期刊：Science

影响因子：44.7

发表时间：2024年10月

研究机构：美国圣裘德儿童研究医院

涉及组学：单细胞转录组、WGBS、ATAC-seq、CUT&Tag等

    该研究揭示了DNMT3A、TET2和ASXL1这三个表观遗传调控因子控制着CD8 T细胞从干细胞样的前体耗竭T细胞（Tpex）向终末耗竭T细胞（Tex）的发育过程。首先作者在一些骨髓增生异常综合征（MDS）患者中，观察到接受抗PD-L1治疗的长期存活者与其T细胞中ASXL1基因的突变相关。由于ASXL1、DNMT3A和TET2突变通常与造血干细胞的克隆性造血（CH）相关，并赋予干细胞生存优势，因此作者探究了这些调控因子在Tpex向Tex发育转换中的作用，以及它们在抗PD-L1治疗期间对治疗持久性的影响。

    研究发现ASXL1基因的缺失能够使T细胞保持干细胞特性和对免疫检查点阻断（ICB）治疗的响应性，这些T细胞在慢性抗原暴露下能够维持数量和功能超过1年，且不会表现出恶性增生。此外，这些研究还揭示了ASXL1通过调节多梳群-抑制性去泛素化酶（PR-DUB）复合体，控制组蛋白2A赖氨酸119的去泛素化，作为Tpex向Tex发育转换的分子检查点。

案例3：单细胞测序锁定m6A修饰TAM调控CD8+ T细胞^[3]

英文标题：The tumor-intrinsic role of the m6A reader YTHDF2 in regulating immune evasion

发表期刊：Science Immunology

影响因子：24.8

发表时间：2024年5月

研究机构：美国希望之城医学中心余建华课题组

涉及组学：单细胞转录组、m6A测序、RIP-seq

    本文先通过TCGA数据库进行泛癌数据，发现YTHDF2在泛癌组织内均表达显著上调，并且与抗肿瘤免疫细胞亚群的浸润呈负相关。紧接着作者对Ythdf2敲除的小鼠肿瘤组织进行单细胞测序发现，Ythdf2敲除肿瘤中观察到抗肿瘤巨噬细胞（M1型）的比例增加，而促肿瘤巨噬细胞（M2型）的比例减少。Ythdf2的缺失导致肿瘤微环境中效应CD8+ T细胞和Ki67+CD8+ T细胞亚群的比例增加。紧接着对肿瘤细胞同时开展转录组测序、m6A测序以及YTHDF2-RIP-seq进行联合分析锁定趋化因子受体蛋白CX3CR1。YTHDF2缺失的肿瘤细胞中CX3CR1mRNA半衰期延长。YTHDF2的这种调节作用可能影响CX3CL1蛋白的分泌，进而影响肿瘤微环境中的细胞迁移。

    扩展阅读：Sci Immunol（IF=27）m6A+单细胞+RIP-seq多组学揭示YTHDF2是肿瘤免疫逃逸靶点

案例4：单细胞测序结合ChIP-seq/CUT&Tag锁定表观因子特异性肿瘤细胞和CAF细胞亚群^[4]

论文标题：Tumor cell-intrinsic epigenetic dysregulation shapes cancer-associated fibroblasts heterogeneity to metabolically support pancreatic cancer

刊登日期：2024年05月

发表杂志：Cancer Cell

影响因子：48.8

研究机构：上海交通大学附属仁济医院薛婧课题组

涉及组学：单细胞转录组、ChIP-seq、CUT&Tag、Bulk转录组测序、代谢组等

    这篇研究中最核心的部分莫过于锁定胰腺癌明星基因SETD2，这是一个非常经典的H3组蛋白甲基转移酶。作者首先通过TCGA以及QCMG数据库胰腺癌患者多组学数据集发现SETD2缺失普遍存在，且与氧化磷酸化OXPHOS相关。

    紧接着对KRASG12D且Setd2缺失小鼠的肿瘤组织进行单细胞测序，发现了Setd2缺失的肿瘤细胞亚群中OXPHOS相关基因表达增强，且脂质代谢相关的CAF亚群更为丰富。

    肿瘤细胞Setd2缺失后，分泌的Bmp2会上调并促进富含脂质的CAFs分化，继而这些CAFs会维持肿瘤生长。

    转录组测序发现Setd2缺失继而引发一种超级增强子相关的乙酰化修饰相关组蛋白H3K27ac表达量异常增加，其他甲基化修饰组蛋白如H3K36me3和H3K27me3也受到了影响。使用CUT&Tag及ChIP-seq检测这几种组蛋白修饰靶基因后发现均为谷胱甘肽代谢、脂质代谢相关基因。总的来说，本研究将CAF异质性与肿瘤细胞中的表观遗传失调联系起来，突出了CAFs与胰腺肿瘤细胞之间以前未被充分认识的代谢相互作用。

扩展阅读：Cancer Cell：单细胞+ChIP+CUT&Tag挖掘肿瘤表观蛋白锁定CAF亚群细胞

案例5：单细胞+ChIP锁定结直肠癌中转移特性肿瘤周细胞TPCs及转录因子TCF21^[5]

英文标题：Novel TCF21^high pericyte subpopulation promotes colorectal cancer metastasis by remodelling perivascular matrix

发表期刊：Gut

影响因子：23

发表时间：2023年4月

研究机构：暨南大学叶文才、张冬梅和陈敏锋课题组

涉及组学：单细胞转录组、转录因子TCF21-ChIP-seq（联川生物提供）、DNA甲基化测序等

    通过单细胞测序对TPCs分选后继续进行亚群分类，所以得到的细胞亚群非常细。后续通过锁定关键转录因子来对亚群进行分类。转录因子TCF21作为一种在TPC特异性表达的蛋白，对后续肿瘤血管周围的基底重排、血管转移微环境构建起到了关键作用。

    然后对特异性的Tcf21 TPCs进行研究，如通过转录因子TCF21的ChIP-seq、转录组测序以及血管周细胞明星基因集（matrix–pericyte）绘制了Venn图，锁定了诸多明星基因，并且与DNA甲基化相关联。

    所以借助CUT&Tag或者ChIP-seq可以对那些通过分选后细胞总量不足，但是又很想研究转录因子或组蛋白修饰的课题，是一个极大的思路开拓。

    拓展阅读：用户文章Gut：单细胞+ChIP锁定结直肠癌中转移特性肿瘤周细胞TPCs

案例6：单细胞+CUT&Tag揭示组蛋白乳酸化促进心梗修复^[6]

论文标题：Histone Lactylation Boosts Reparative Gene Activation Post-Myocardial Infarction

刊登日期：2022年11月

发表杂志：Circulation Research

影响因子：16.5

研究机构：哈尔滨医科大学附属第二医院心内科于波、张毛毛、吴健教授课题组

涉及组学：单细胞转录组测序、Bulk转录组测序、组蛋白乳酸化CUT&Tag等

    本研究首先对心梗后采集的血液样本进行单细胞测序，锁定了2类特殊的单核细胞亚群可能参与心梗修复（这类单核细胞中修复基因表达被激活）。WB和免疫荧光染色显示，包括先前鉴定的组蛋白H3K18乳酸化在内的组蛋白乳酸化水平在心肌梗死后早期的单核-巨噬细胞中增加。通过CUT&Tag和转录组测序联合分析（IGV图展示），鉴定了Lrg1、Vegf-a和IL-10作为组蛋白乳酸化修饰H3K18la的靶基因。这些靶基因在心肌梗死后的修饰和表达水平增加。因此组蛋白乳酸化通过促进修复基因转录来调节单核-巨噬细胞的抗炎和促血管生成的双重活性，并确认组蛋白乳酸化有利于修复微环境的形成，改善心肌梗死后的心脏功能。

    拓展阅读：Circ Res：单细胞+CUT&Tag揭示组蛋白乳酸化促进心梗修复

案例7：单细胞测序锁定m6A修饰TAM调控CD8+ T细胞^[7]

论文标题：The loss of RNA N6-adenosine methyltransferase Mettl14 in tumor-associated macrophages promotes CD8 T cell dysfunction and tumor growth

刊登日期：2021年07月

发表杂志：Cancer Cell

影响因子：48.8

研究机构：中国科学院北京基因组研究所韩大力课题组、清华大学免疫所徐萌课题组

涉及组学：单细胞转录组、m6A测序、Bulk转录组测序等 

    通过单细胞测序锁定特殊的C1q+肿瘤相关巨噬细胞中存在与CD8+ T细胞存在互作，而这类C1q+ TAM细胞亚群中具有一些m6A甲基化特异性分子表型。随后借助m6A测序技术，发现TAM中一些影响抗肿瘤CD8+ 效应T细胞功能失调的基因如Ebi3出现m6A修饰上的差异，最终导致CD8+ T细胞在结直肠癌患者组织内浸润程度降低。表观组学m6A测序为后续在患者体内开发靶向巨噬细胞上METTL14-YTHDF2轴潜在免疫治疗方法提供了新的途径。

    扩展阅读：Cancer Cell∶m6A修饰TAM调控CD8 T细胞命运新机制 | m6A专题

    所以通过这7个典型的案例，我们发现当做完了单细胞测序后，搭配表观组学的大致思路有两种情况，这决定着是先从表观组学入手还是单细胞测序入手，具体情况如下：

    ① 已知某种表观因子情况下直接在单细胞测序结果中寻找特异亚群，如通过TCGA或者其他来源的数据提前得知某类基因与肿瘤代谢或免疫浸润相关。例如案例2中的YTHDF2和案例3中的SETD2均来源于TCGA的数据挖掘，后续单细胞测序锁定的亚群均围绕明星分子展开。

    ② 在对某种或某几类表观因子未知的情况下，则需要对单细胞测序结果进行盲筛。例如案例4中的转录因子TCF21以及案例5中的组蛋白乳酸化H3K18la，均在确定是某个具体的细胞亚群后开展数据挖掘才确定的。

    因此无论如何，基本上目前都是先通过单细胞测序必须挖掘到一类具体具有重要调控作用的细胞亚群。这类细胞亚群中，往往也挖掘到了特异性表达的表观因子如m6A修饰酶、转录因子或组蛋白修饰，这些表观因子可以是提前知道的也可以后期数据挖掘过程中才锁定的。但往往这类细胞亚群往往占比或者含量不大，即便是通过磁珠或者流式分选后数量也有限，只能使用CUT&Tag技术。如果是某一类组织，无法进行分选，由于该转录因子或组蛋白只在特异性的细胞亚群内表达，使用ChIP-seq或ATAC-seq也是可行的。

    后续讲故事的点分为直接调控与间接调控，例如在案例4和案例6中，表观因子直接调控细胞亚群发挥作用。而案例3、案例5和案例7中，表观因子调控细胞亚群通过crosstalk作用间接调控另一类细胞亚群。

    下面我们来看一下，单细胞测序与表观测序相关联的具体例子，来看下课题设计的技术路线示意图，并对常见表观因子进行了罗列：

[1] Ma S, Dahabieh MS, Mann TH, et al. Nutrient-driven histone code determines exhausted CD8+ T cell fates. Science. Published online December 12, 2024.

[2] Kang TG, Lan X, Mi T, et al. Epigenetic regulators of clonal hematopoiesis control CD8 T cell stemness during immunotherapy. Science. 2024;386(6718):eadl4492.

[3] Xiao S, Ma S, Sun B, et al. The tumor-intrinsic role of the m6A reader YTHDF2 in regulating immune evasion. Sci Immunol. 2024;9(95):eadl2171.

[4] Niu N, Shen X, Wang Z, et al. Tumor cell-intrinsic epigenetic dysregulation shapes cancer-associated fibroblasts heterogeneity to metabolically support pancreatic cancer. Cancer Cell. 2024;42(5):869-884.e9.

[5] Li X, Pan J, Liu T, et al. Novel TCF21high pericyte subpopulation promotes colorectal cancer metastasis by remodelling perivascular matrix. Gut. 2023;72(4):710-721.

[6] Wang N, Wang W, Wang X, et al. Histone Lactylation Boosts Reparative Gene Activation Post-Myocardial Infarction. Circ Res. 2022;131(11):893-908.

[7] Dong L, Chen C, Zhang Y, et al. The loss of RNA N6-adenosine methyltransferase Mettl14 in tumor-associated macrophages promotes CD8+ T cell dysfunction and tumor growth. Cancer Cell. 2021;39(7):945-957.e10.

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