可变剪切，也叫做选择性剪切（Alternative splicing，AS）, 指的是在mRNA前体到成熟mRNA的过程当中，不同的剪切方式所产生的RNA的外显子以多种方式进行重连，使得同一个基因可以产生多个不同的成熟mRNA，最终产生不同的蛋白质。
可变剪切属于基因结构变异分析，是转录组测序的基本分析内容。在常规二代测序的bulk转录组数据中，使用rMATS可以很好地支持有生物学重复和单样本的组间差异可变剪切分析，是一款同时定性和定量的分析工具。在全长转录组分析中通常使用SUPPA2、SpliceMap-LSC-IDP pipeline和AStalavista进行可变剪切分析，AStalavista相较SpliceMap-LSC-IDP pipeline工具检出效率要高很多。需要注意的是，AStalavista更擅长定性分析，如果需要定量，则不建议作为优先选项。
可变剪切的类型如下，不同工具分析出的剪切类型覆盖是有区别的，比如rMATS一般只能分析五种剪切类型，而AStalavista使用通用符号系统，可以明确描述任何AS事件。
AA（Alternate acceptor site）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本，5'端剪接位点一致但3'端剪接位点不同，第二种转录本的3'端外显子有所延长。
AD（Alternate Donor site）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本，3'端剪接位点一致但5'端剪接位点不同，第二种转录本的5'端外显子有所延长。
AP（Alternate promoter）：基因的两个转录本的区别在于第一个外显子不同，称为Alternative First Exon。
AT（Alternate terminator）：基因的两个转录本的不同之处于最后一个外显子不同，称为Alternative last exon。
ES（Exon skip）：指一个外显子从初始转录物上被剪切掉。
ME（Mutually exclusive exons）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本，两转录本之间相同的外显子称为constitutive exon，不同的外显子称为inclusive exon，两个inclusive exon不能同时存在与同一转录本中，只能分别存在于不同转录本中。
RI（Retained intron）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本，第2种转录本由retained intron与两侧的外显子一起形成新的外显子。
1）Astalavista安装
使用conda安装Astalavista，指令为：
conda search Astalavista
conda install Astalavista
2）gft文件准备
Astalavista基于基因注释gtf文件进行可变剪切分析，分析转录本间剪切事件的总和，示例gtf文件如下：
3）Astalavista运行
/usr/bin/Astalavista -t asta --threads 2 -i novel.merged.gtf -o novel.as.gtf.gz
## 默认AStalavista仅报告内部AS事件（ASI）,包含TSS和/或CVS的外部AS事件（ASE）也可以包含在报告的事件类型列表中，可以加参数：-e ASI,ASE
## 默认AStalavista只显示成对AS事件，即正好有两个变体的事件（维度2）；更高维度的事件被投影到其所有变体对之间的事件。参数EVENTS_DIMENSION（flag -d）必须设置为相应的整数值或“-1”，以输出所谓的完整AS事件：-d -1
## -t 指定astalavista使用的分析工具，默认为asta，进行可变剪切事件鉴定，另外还可以使用sortBED、sortGTF、subsetter等工具
## -i 输入文件
## --threads使用线程数
## 输出结果为gtf.gz，否则可能格式错误，无法打开
4）structure类型转换
基于code和events的关系进行类型的转换：
perl as_code2events.pl AS_code.txt AS_event.txt
Astalavista输出可变剪切结果为gtf格式，如下 ：
## 结果输出形式为gtf形式，其中structure部分，分别用数字、"^","-"符号表示可变剪切发生的相对位置、供体和受体位点。剪切中，前一外显子称为剪切供体，后一外显子称为剪切受体。
## 如'0,1-2^'代表SE类型；'1-,2-'代表A3SS类型；'1^,2^'代表A5SS类型；'1-2^,3-4^'代表MXE类型，互斥外显子；'0,1^2-'代表IR类型等。
## 大多数研究使用：“exon skipping,” “alternative donor/acceptor,” “intron retention,” and (sometimes) “mutually exclusive exons”
## AStalavista使用通用符号系统，可以明确描述任何AS事件。命名法为每个可变剪接位点序列分配了一个“AS代码”，AS代码根据其在事件中的相对位置及其类型，用数字和符号表示每个可变位点。
## 特定AS事件的代码生成如下：首先，事件中包含的所有可变位点都根据其在转录方向上的位置进行排序，从5′到3′。每个位点都根据此顺序（1、2、3等）分配一个数字，并根据其类型分配一个符号：
## [“for TSS, ”] 对应CVS
## ^：donor，供体
## -：acceptor，受体
## 来自同一转录本的位点由连续的这样的“数字-符号”对（以相应的5'→3'顺序）表示，形成一个表示AS事件的字符串。
## 如果事件的其中一个转录本中没有可变位点（例如，描述跳过外显子的转录本的字符串），则使用数字“0”作为相应的字符串。然后，AS代码是由此获得的字符串的逗号（“,”）分隔连接，每个转录变体中的一个，按其编号排序。
## 事件的开始（第4列）和结束（第5列）分别是定界公共位点的基因组坐标，第一个/ASE事件中的最后一个可变位点
## degree：总结了事件中可变位点的数量，随着事件越长或变种越多，degree自然会增加。
## dimension：表示有关报告事件相对于潜在完整事件的信息，表示为“X_Y”形式的字符串，其中X是报告事件中的变体数量，Y是在相应的完整事件中的事件数量。X = Y的所有事件都是完整的，而X<Y的事件则不完整（根据定义，X>Y是不可能的）
## “transcript_id”：描述了事件的每个变体结构的转录标识符的逗号分隔列表；如果有多个记录支持事件的某个变体，则相应的标识符还用“/”分隔符分隔。
## “splice_chain”：描述事件中每个可变位点的基因组坐标，变体与“transcript_id”的标识符以逗号分隔的顺序相同。
## “splice_chain”的值可以被认为是事件的唯一标识符。
AS code示意图如下：
AStalavista使用通用符号系统，可以明确描述任何AS事件。
命名法为每个可变剪接位点序列分配了一个“AS代码”，AS代码根据其在事件中的相对位置及其类型，用数字和符号表示每个可变位点。
分别用数字、"^"、"-"符号表示可变剪切发生的相对位置、供体和受体位点。剪切中，前一外显子称为剪切供体，后一外显子称为剪切受体。
0,1-2^'代表SE类型；'1-,2-'代表A3SS类型；'1^,2^'代表A5SS类型；'1-2^,3-4^'代表MXE类型，互斥外显子；'0,1^2-'代表IR类型等。
软件在2007年发表于Nucleic Acids Research：
文章名：《ASTALAVISTA: dynamic and flexible analysis of alternative splicing events in custom gene datasets》
期刊：Nucleic Acids Research
IF：16.6
发表日期：2007-7-1
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