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临床组织千千万，组织区域万万千，老师们该怎么在有限研究投入范围内合理选择组织和组织区域？哪些组织和区域做了检测却可能如小小石子投入水里连个水花都看不到？哪些组织和区域选择可以事半功倍，小小队列就可以获得大大的收获？精准选择候选区域，合理规避组织特性风险，是老师们开展空间转录组学检测时需要慎重思考的。联川时空在上千例的组织检测服务中，将结合组胚病理学知识和实际检测数据所沉淀的宝贵经验在本篇呈现给老师们。空转转录组学作为新兴的高精度分子病理学重要技术，是将组织细胞的转录信号与组织空间特征紧密联合贯穿起来，与bulk-RNA seq以及sc-RNA seq相比最大的优势，就在于可以同步实现具体空转位置上细胞的转录信息，且可以展现实际不同细胞之间的区别和联系，典型如肿瘤微环境研究肿瘤细胞侵袭前沿时不同细胞类型的病理变化。因此，我们无法脱离病理空谈转录表达，务必要结合临床病例的症状和病理特征合理选择检测样本及区域。空间转录组是一项检测细胞内转录表达水平的技术，并不是毫无限制的技术，因此我们也无法检测到在病理上已经无法识别细胞的区域，典型如骨组织已经高度钙化的部分没有细胞，是万万不可能再获得该区域转录信号的。市场上的空转组学技术均在开发过程中就锁定了质控标准，以10xGenomics和华大时空两个平台来说，在针对冰冻组织和石蜡组织均设定了核酸完整性层面上的指标（RIN值和DV200）。很多老师也认为只要通过了该指标阈值就可以万无一失的开展检测。但，核酸完整性只是指征该片组织的整体核酸水平可供检测，但是转录检测水平的高低，以及更重要的与空间结构的匹配性关联，是与组织形态相关联的。如果一片捕获区域内组织均是结缔组织，那么肯定不可能和另一片捕获区域内均是上皮组织的转录表达水平相提并论的（体现在基因中位数或者平均捕获UMI数值）。同理，如果组织区域内同时存在正常组织、癌组织、坏死组织，那么坏死组织通常是没有信号产出的，这时候从检测成本和数据能用性质量角度我们就要考虑坏死组织占比是否不能过高。 以当前最新的10xVisium HD平台为例，其数据质量的评估可以从多个方面着手，用户第一时间关注的是Mean UMIs per 8um bin这个指标，该指标类似于单细胞数据中的每细胞UMI计数，反映了每个细胞的转录活性水平。但目前10x和学术界都还没有标准评价的数值。这个数值依蜡块质量、样本类型、样本内细胞成分等因素而变化。10x官方数据集（肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺等）的mean UMI per 8 um bin在200-700之间。但是我们也需要知悉的是10x官方数据对应的样本类型属于转录活性偏高的，并且样本制备流程和样本质量都非常标准，因此，这些数据是优秀的结果。根据我们的项目经验，实际实验的样本，尤其是历史性临床样本与10x官方数据还是会存在差别，对应的UMI值和转录本数量也会有差异，mean UMI per 8 um bin范围存在波动，很难有一个标准评价水平，一般我们认为基因数或UMI足够下游分析即可，有些低基因数就是与样本真实表达情况挂钩，比如于组织区域中如果包含很多非细胞区域，该值相对的会被拉低。 因此，我们需要结合病理从以下4个方面，来综合评估检测结果的优秀与否。结合H&E染色与表达区域内转录信号判断表达是否与细胞类型趋势一致，如间质区胶原纤维处无转录信号。
在Clusters板块下进行查看，表达区域Clusters分布与H&E呈现的组织病理结构的吻合程度，吻合程度越高，提示数据质量越好。图、官方提供HD检测数据案例（Clusters分布与H&E吻合性分析）在Features板块下进行查看UMI的表达分布，下图展示的是Log转换后的UMI表达分布，可以明显的看出高表达区域（橙色）和低表达区域（紫色），将该情况与H&E的图片进行比较，一般有较好的吻合性（如细胞稀疏的平滑肌区域、成纤维细胞区域通常表达量低，致密的癌细胞区域通常表达量高）。图、官方提供HD检测数据案例（高低表达吻合性分析）正如前面所提的Mean UMIs per 8 um会受到样本中的细胞组成的影响，由于非细胞区域会拉低该值，我们可以对非细胞区域去除后，绘制所有barcode的小提琴图，产生一个去除掉非细胞区域后的mean UMI来对数据质量进行评价过滤后，mean UMI 多有提升。 图、官方提供HD检测数据案例（过滤低质量区域后mean UMI分析）如上所述，空转的质量评价体系离不开结合组织病理的分析，以数据可用性为指导展开进一步的机制研究。组织的固有特征与转录本检测水平是直接挂钩的。人体组织分为四大类型，包括上皮组织、结缔组织、肌组织、神经组织，各自具有其功能特征。上皮组织覆盖在身体表面，保护内部结构免受外部环境的侵害；结缔组织则提供了支撑和连接，使不同部分能够协调运作。组织形成器官，器官再组合成系统，可分为八大系统运动系统、神经系统、内分泌系统、循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统和生殖系统。图、四大组织类型（图片来自Langman's Medical Embryology 14 Edition 2018，侵删）空转转录组研究的对象一般分为三大类，一类是发育有关，典型研究对象脑组织；一类是疾病有关，典型研究对象是各种肿瘤组织，也有其他研究领域如纤维化、炎症损伤等病变；还有一类是与育种有关，比如肌肉、脂肪等。整体而言，都绕不开四大组织类型，以及组织构成的各类器官结构。首先我们从组织层面阐述表达水平偏低的类型，主要是肌组织和结缔组织；其次，我们从器官系统层面，举例典型的低表达趋势样本类型。肌组织主要由具有收缩功能的肌细胞构成。肌细胞间含有少量结缔组织、血管、淋巴管及神经。肌细胞：又称肌纤维，其细胞膜称为肌膜，细胞质称为肌浆。肌组织分为骨骼肌、心肌和平滑肌三种，前两种属于横纹肌。骨骼肌受躯体神经支配，属于随意肌，心肌和平滑肌受自主神经支配，属于不随意肌。骨骼肌用于移动骨骼。心肌位于心脏，负责将血液泵入循环系统。平滑肌负责各种不自主的运动，例如，寒冷或害怕时头发会竖起来，或者将食物输送到消化系统。图、肌组织类型（图片来自LibreTextsTM medicine，侵删）平滑肌在各类脏器组织中常见，具有纺锤形细胞，末端逐渐变细(A)，并且具有位于中心的核.由于这种形状，从横向看部分肌纤维看起来有不同的直径，只有从中心切开的肌纤维才会显示出核(B)。图、平滑肌（图片来自平滑肌Jennifer Lange《纤维》，侵删）平滑肌纤维是梭形细胞，收缩时会从各个方向向内收缩，其存在于膀胱等中空器官的壁中，子宫，胃、肠道以及通道壁，例如循环系统的动脉和静脉，以及呼吸、泌尿和生殖系统的管道。平滑肌也存在于眼睛中，作用是改变眼睛的大小虹膜并改变形状镜片;并在皮肤上引起头发挺立回复对寒冷或恐惧。 含有肌组织的样本因肌细胞体积大，细胞核密度小、肌纤维比例高的特征，存在整体组织粘附性低、细胞基因表达水平低等特点。针对纯肌肉组织研究，尤其期望研究脂肪结合肌肉的案例，如果是采用冰冻组织，在切片过程中存在易脱片、水分高导致不容易成片、以及含水量导致大量冰晶的形态问题，经验显示起检出水平也偏低。而石蜡组织，一般是在器官组织中存在，如肠道、食管、卵巢等均存在肌肉层，在该等区域存在与粘膜层上皮细胞显著偏低的表达水平，除指定研究目的外，建议尽量选择肌组织面积比例小的区域。此外，心脏基本都是心肌细胞构成，肌肉类型表达水平相对偏低，存在相应风险，属于组织特性。10x官方测试过的组织类型，心脏样本在Visium v2测试过的样本里算有挑战的样本，主要的原因是基因检出数低，聚类结果不好，具体参考:https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tested-tissues。结缔组织（connective tissue）由细胞和大量细胞外基质（又称细胞间质）构成。结缔组织的细胞外基质，包括无定形的基质、细丝状的纤维和不断循环更新的组织液。细胞散居于细胞外基质内，无极性。结缔组织在体内广泛分布，具有连接、支持、营养、运输、保护等多种功能。一般所说的结缔组织指固有结缔组织。 固有结缔组织包括疏松结缔组织、致密结缔组织、脂肪组织、网状组织。广义的结缔组织包括液态的血液、柔软的固有结缔组织和坚硬的软骨和骨。 日常检测工作中更常见的是组织包括了固有结缔组织的区域。因此，笔者着重介绍这些组织类型的特性及表达特征。疏松结缔组织是由细胞、纤维和基质三种成分组成的，细胞与纤维的含量较少，基质的含量较多。细胞包括成纤维细胞、浆细胞、巨噬细胞、肥大细胞、脂肪细胞、间充质细胞等，这些细胞具备相应转录本。此外，血液中的白细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等在炎症反应时也可游走到结缔组织内。这样，结缔组织内相应细胞分散在细胞间质里。而细胞间质则由胶原纤维、弹性纤维、网状纤维三种纤维和蛋白多糖类基质组成，因此疏松结缔组织因其实际细胞分布的不致密，导致该区域空间转录本检测水平是偏低的。比如胃肠组织在研究黏膜下层时，就存在该区域相比粘膜层表达信号是明显偏低的特征。 图、真皮中疏松结缔组织结构（来源：Netter's Essential Histology With Correlated Histopathology 3rd Edition 2020） 致密结缔组织（dense connective tissue）是一种以纤维为主要成分的固有结缔组织，纤维粗大，排列致密，以支持和连接为其主要功能。根据纤维的性质和排列方式，可区分为规则致密结缔组织、不规则致密结缔组织、弹性组织。规则致密结缔组织主要构成肌腱、韧带和腱膜，其大量密集的胶原纤维顺着受力的方向平行排列成束，细胞成分很少；因此不建议进行该类组织的空间转录组检测，数据过滤后极有可能无法有效分析。 图、肌腱（来源：Netter's Essential Histology With Correlated Histopathology 3rd Edition 2020）不规则致密结缔组织见于真皮、硬脑膜、巩膜及许多器官的被膜等，其特点是粗大的胶原纤维彼此交织成致密的板层结构，纤维之间含少量基质和成纤维细胞；因此典型的如皮肤组织，空间转录组数据显示表皮信号明显高于真皮区域。图、致密不规则结缔组织（DI）呈显紧密交织的网络，而疏松结缔组织（Lo）则呈现松散的胶原纤维排列模式。箭头是成纤维细胞。来源：Netter's Essential Histology With Correlated Histopathology 3rd Edition 2020 弹性组织是以弹性纤维为主的致密结缔组织。粗大的弹性纤维或平行排列成束，如项韧带和黄韧带。该类组织也因细胞过少原因不建议开展空转检测。脂肪组织呈现规则的椭圆形或多边形，胞质内的脂滴在制备冰冻或石蜡组织时，会被溶解，因此胞质呈现空泡状。细胞核较为扁平，被脂滴挤压到细胞的一边。图、脂肪组织示意（来源：组织学与胚胎学彩色图谱（实习用书·2版）. 唐军民，李英，卫兰主编）因此该类组织的细胞核过少、且切片时可能存在层面导致未涵盖细胞核，导致空转检测几乎无信号。仅关注该类组织的研究者应知悉其组织特性导致的极低数据风险，且研究时选择更合适的方案，比如更厚的组织切片厚度选择。以10xGenomics官方发布的案例看，该例人胰腺组织，可见左上角的血管和右下角的脂肪组织几乎无表达信号。 图、10x官方数据Visium_HD_Human_Pancreas - Gene expression library of Human Pancreas (Visium HD)由网状细胞 (reticular cell)、网状纤维和基质构成。网状细胞是有突起的星状细胞，相邻细胞的突起相互连接成网。网状纤维由网状细胞产生。网状组织可为淋巴细胞发育和血细胞发生提供适宜的微环境。图、网状组织HE染色（来源：组织学与胚胎学彩色图谱（实习用书·2版）. 唐军民，李英，卫兰主编）淋巴结被膜下或者淋巴结中央区有疏松而染色浅的部位（淋巴窦），该区域存在网状组织，可以观察到网状细胞、淋巴细胞和巨噬细胞。免疫细胞的转录检测水平决定于其采集固定瞬时的表达水平，处于不同时期可能有或高或低的变化。除了固有结缔组织，广义结缔组织的骨和软骨具备典型的组织特性，除胚胎发育期或极小月龄的小鼠模型存在检测的可行性，其他的成年骨组织、病理性（如风湿性关节炎）类的骨及软骨，由于存在活跃转录本的细胞数量极少，且质地导致与玻片的粘附性很差，因此并不建议开展空转转录组检测。图、小鼠发育中的关节透明软骨（左）和透明软骨（右）（来源：Netter's Essential Histology With Correlated Histopathology 3rd Edition 2020）图、骨组织截面（骨细胞（Os）被骨基质包围；Ocl破骨细胞位于骨基质表面；来源：Netter's Essential Histology With Correlated Histopathology 3rd Edition 2020） 皮肤组织表达特性：表达分布于表皮层富含细胞的部分；真皮层系胶原结缔组织，除散落分布的神经、血管、腺体等细胞结构外，几乎无表达信号。表皮，是一种可自我再生的复层鳞状上皮，产生角蛋白为主的保护性蛋白质层。表皮是最表层的，与外部环境相互作用。表皮分为四层：①基底细胞层：将表皮与真皮分开的基底层上的一排柱状细胞。②棘层：短突起，通过桥粒附着到相邻细胞。③颗粒层：角质细胞已变成含有角质透明颗粒的鳞状细胞。④角质层：表皮最表层是无细胞角质层。该层形成的角蛋白是细胞角蛋白和透明角质的组合。图、皮肤表皮层结构（图片来源学习网站及原文教材，侵删）真皮，是一层致密的胶原结缔组织，富含弹性组织，并含有大量毛囊、汗腺、血管和淋巴管、感觉受体、神经以及结缔组织细胞。真皮由两层组成：①乳头层 - 真皮最表层是乳头层，由紧邻表皮基底膜下方的疏松结缔组织组成。②网状层 - 网状层由致密、不规则的胶原结缔组织组成。大多数血管、神经和感受器在乳头层。我司的皮肤检测经验与已发表文章一致，高表达信号分布于皮肤表层，真皮层存在散落低信号，亦与皮肤组织特性一致。图、皮肤组织空转表达（文献来源doi.org/10.1038/s41467-023-39484-4）从空转检测实验方面考虑，皮肤组织容易自溶，如若处理不及时，自溶后RNA降解；皮肤组织粘附性差，实验过程中容易脱片；因此更容易产生无法执行完整实验的风险，产生相应费用损失。此外，从皮肤表达特性上考虑，表皮层极薄的组织，建议审慎开展；尤其是造模的皮肤组织，建议提前确认是否存在过多低表达或无表达的区域。皮肤肿瘤检测结果较为理想，因为肿瘤病变带来大量高转录的病变细胞，同时病变增加了皮肤的可透化程度，使更多基因得以释放检测。10x官方也仅将黑色素瘤作为推荐开展的组织类型，而非肿瘤的皮肤组织列示为高风险样本，建议审慎开展。我司开展皮肤类型的检测经验较多，在开展项目前，请咨询我司技术人员，充分评估风险并采用相应优化措施，以降低该类型样本的检测风险。血管壁的一般结构除毛细血管外，血管壁从管腔面向外依次分为内膜、中膜和外膜。图、动脉结构vs静脉结构:内膜、中膜、外膜（来源:JUNQUEIRA'S Basic Histology TEXT&ATLAS）由内皮、内皮下层和弹性膜构成。内皮（endothelium） 是衬贴于血管腔面的一层单层扁平上皮。细胞大多呈梭形，核突出，其长轴与血流方向一致，为血液的流动提供一个光滑的平面。内皮下层 （subendothelial layer）是位于内皮和内弹性膜之间的薄层结缔组织，内含少量胶原纤维和弹性纤维。内弹性膜 （internal elastic membrane） 有的动脉的内皮下层深面还有一层内弹性膜，由弹性蛋白组成，膜上有许多小孔。在血管横切面上，因血管壁收缩，内弹性膜常呈波浪状。中膜（tunica media）的厚度及组成成分因血管种类而异：大动脉以弹性膜为主，其间有少许平滑肌；中动脉主要由平滑肌组成，肌间有弹性纤维和胶原纤维。血管平滑肌纤维比较细，并常有分支。肌纤维与内皮细胞之间形成肌内皮连接（myoendothelial junction），平滑肌可借助于这种连接，与内皮细胞或血液进行化学信息交流。在病理状况下，动脉中膜的平滑肌可移入内膜增生并产生结缔组织，使内膜增厚，是动脉硬化发生的重要病理过程。中膜的弹性纤维具有使扩张的血管回缩的作用，胶原纤维起维持张力的作用，具有支持功能。外膜（tunica adventitia）由疏松结缔组织组成，其中含螺旋状或纵向分布的弹性纤维和胶原纤维，并有小血管和神经分布。有的动脉在中膜和外膜的交界处还有外弹性膜（external elastic membrane），外弹性膜也由弹性蛋白构成，但较内弹性膜薄。血管组织特性决定了转录本检出水平低：血管富含纤维物质，活跃表达的细胞类型仅主要分布于内膜层的内皮细胞，但细胞数量有限，中膜的肌组织表达低、外膜的疏松结缔组织表达密度低，整体评估并不适合用于空间转录组分析，而更适合针对蛋白的检测方案。已有检测经验显示基因中位数极低，过滤后无法有效分析。同时，组织特性决定了实验过程中可能产生异常：疏松结缔组织，尤其胶原纤维、弹性纤维等粘附性不佳，易脱片、破损。图、血管的典型结构富含疏松结缔组织、平滑肌、纤维而少含上皮细胞有很多老师研究方向是粥样硬化斑块，但是因为硬化斑块主要是非细胞物质，如脂质堆积硬化导致，所以不要对斑块尝试进行常规空间转录检测。图、弹性动脉示意和动脉粥样硬化结构示意（来源：DIAGNOSTIC PATHOLOGY: NORMAL HISTOLOGY, 2E By Lindberg Matthew R. Md）肺部主要由支气管、小支气管、肺泡管及肺泡所组成。正常肺组织具备非常丰富的管腔结构。肺动脉的主要功能是把静脉的血液送进肺部，之后到达肺泡壁上构成微血网，接着与肺泡进行气体交换，最后从肺静脉将带氧的血液送回心脏；每个肺部都有两条肺静脉及成千上万的微血管。肺动脉由血管內皮细胞、平滑肌及纤维组织组成，总是与支气管伴行，且管径与支气管相当，直到终末细支气管。肺泡壁表层的细胞有两类：I型肺泡细胞（type I alveolar cell），又称鳞状肺泡上皮细胞，或称小肺泡细胞，占肺部总表面积95%以上。主要形成肺泡壁的连续内衬，上面分布许多微血管，使大量气体进行交换。II型肺泡细胞（type Ⅱ alveolar cell），又称中隔细胞。可分泌表面张力素，防止肺泡塌陷，深呼吸时增加分泌，让肺更容易扩张。图、肺泡工作示意图（来源：Histology：A Text and Atlas：With Correlated Cell and Molecular Biology,9th 2023）图、肺泡和肺泡巨噬细胞（来源：Histology：A Text and Atlas：With Correlated Cell and Molecular Biology,9th 2023）肺部还有巨噬细胞或称做尘细胞（dust cell），可分解外来侵袭物。巨噬细胞将吞噬肺泡腔内细胞碎片和吸入环境污染物（如灰尘颗粒、二氧化硅、香烟焦油和微生物），之后会迁移回肺泡间隔，呈现不规则形状，胞内装载着黑色的包涵体。肺泡腔内还存在一种肺泡巨噬细胞，吞噬红细胞后，鞋带含铁血黄素呈现棕色胞质。图、肺结构（儿童的肺）：支气管(B)、细支气管（B）、肺泡网(A)和胸膜外覆盖层(P)（来源：STEVENS & LOWE’S HUMAN HISTOLOGY, FOURTH EDITION）图、正常肺的典型结构（来源：Histology：A Text and Atlas：With Correlated Cell and Molecular Biology,9th 2023）无论是人还是小鼠，正常肺组织均存在非常多的管腔结构，支气管、小支气管、肺泡管及肺泡、血管，其构成单元主要有上皮细胞、吞噬细胞、平滑肌细胞等，相对高表达的是上皮细胞、免疫细胞，低表达是平滑肌细胞，无表达是纤维结构。由于产生相对高表达信号的细胞密度并不高，所以整体的正常肺组织可检出的平均表达信号是偏低的。同时，由于肺泡结构分散，在组织制备和实验过程中也存在挑战。比如，制备肺的新鲜冰冻包埋组织时，如果不灌注容易导致肺泡塌陷形状破碎，灌注则也可能由于粘稠的OCT导致结构损坏，而低浓度的OCT则可能导致水分过分残留导致严重冰晶；制备肺组织的石蜡包埋块时，固定时如果不够充分，则也会产生形态上的破坏以及核酸的不完整；肺组织在长时间液体反应的环境中（空转实验过程），稀疏的肺泡结构可能因为粘附性不足导致与玻片脱开，或者在实验转片的压力下产生移位或折叠，严重影响数据结果。因此，对于正常肺组织，应选择核酸完整性更高、结构相对完整的样本开展，一般小鼠肺组织表现更佳（新鲜采集制备组织），人的正常肺组织、或肺气肿、尘肺、早期肿瘤周围仍存在相对正常肺泡结构的组织，检测的空间转录水平信号一般。以小肠道组织来说，取空肠结构为代表，可分为黏膜（可观绒毛、肠隐窝）、黏膜下层、肌层、浆膜层，其具有典型的病理结构对应转录水平。如肠癌发生在黏膜层，肿瘤细胞可能侵犯黏膜下层、肌层，免疫细胞随之分布在相应区域。空肠结构可分为黏膜（可观绒毛、肠隐窝）、黏膜下层、肌层、浆膜层（来源：Histology：A Text and Atlas：With Correlated Cell and Molecular Biology,9th 2023）空肠绒毛结构（来源：Histology：A Text and Atlas：With Correlated Cell and Molecular Biology,9th 2023）空肠绒毛由肠上皮细胞（En）和杯状细胞（GC）组成的简单柱状上皮覆盖在其表面。中心是固有层，是一种高度细胞性的结缔组织，包含一个中央乳管（La）、毛细血管（Cap）和一簇簇平滑肌细胞（SM）。不同的组织细胞结构呈现不同的转录表达水平检出，尤其是肿瘤组织中，癌细胞和肿瘤外间质、癌旁组织的表达趋势明显不同。以10x Genomics官方公布3例肿瘤组织为例阐释HD空间转录组不同表达分布特征。图、10x官方数据Visium_HD_Human_Lung_Cancer_Fixed_Frozen - Gene expression library of Fixed Frozen Human Lung Cancer (Visium HD)该例人肺癌组织，肿瘤侵入肌层，而癌旁同样在肌层，不同的肿瘤细胞浸润状态、免疫状态显示不同的表达丰度，整体而言非肿瘤浸润的肌层表达是偏低的，通过Graph-based clustering无监督聚类时显示不同的族群。图、10x官方数据Visium_HD_Human_Colon_Cancer - Gene expression library of Colon Cancer (Visium HD)该例人肺癌组织，粘膜层肿瘤细胞、正常肠隐窝区域的细胞表达存在明显差异，黏膜下层结缔组织、平滑肌层显示相对极低表达，但细胞聚类时仍显示该些低表达区域是与组织类型相符。图、10x官方数据Visium_HD_Human_Breast_Cancer_Fresh_Frozen - Gene expression library of Fresh Frozen Human Breast Cancer (Visium HD)该例人乳腺癌组织，肿瘤的实质细胞区域高表达，而肿瘤外间质（结缔组织、血管、淋巴管等支撑营养作用）的区域呈现明显低表达，与组织特性相符。病理性质也显著影响空间转录组检测水平，典型的如坏死、梗死、纤维变性、脂肪变性、炎症过强、出血严重、钙化等。当局部组织、细胞新陈代谢停止后，其功能完全丧失。细胞可出现核浓缩、核碎裂及核溶解等变化。根据经验，组织样本中发生坏死，或趋向坏死的病变，导致胞内发生变化核酸降解，同样检测数据中这些区域的基因表达水平较低甚至无表达。空转的检测建议是在选片过程中，要尽量避开坏死部位。但针对临床研究，如用药后缓解的病例常发生伴随的损伤及坏死，该类组织并非一定不能进行空转检测，而是应该结合课题队列设计，建议在有限的区域内尽量减少坏死区域的比例，侧重研究坏死组织与临近组织细胞间的相互关系，从而有效利用单次空间转录组检测的捕获范围。历史的研究文献显示，以脑胶质瘤研究为例，该疾病发生常伴随坏死，文献内确实存在一组样本内存在部分组织由于“质量过差（数据检出过低）”导致无法用于合并分析的情况。因此，合理设计课题，结合组织HE染色及其他辅助检测如mIF或mIHC等，做好检测前评估至关重要。图、组织缺血性损伤及坏死状态（图片来源：罗宾斯基础病理学教材）图、肾脏组织的梗死状态（N正常；I梗死灶，图片来源罗宾斯基础病理学教材）图、肾小管坏死（来源：罗塞和阿克曼外科病理学（第11版））图、坏死区域检出极低表达（Acta Neuropathol Commun. 2024; 12: 64.）细胞可逆性损伤包括细胞水肿、脂肪变、玻璃样变、淀粉样变、粘液样变、病理性色素沉着、病理性钙化。其中，将明显影响转录组表达检测的病变应是脂肪变、玻璃样变、淀粉样变、粘液样变等明显降低细胞密度的病理变化。细胞水肿也称水变性，是细胞损伤中最早出现的变化。细胞肿大明显，细胞基质高度疏松呈现空泡状，细胞核也产生肿胀。脂肪变是指甘油三酯蓄积在非脂肪细胞的胞质中。常发生于肝细胞、心肌细胞、肾小管上皮细胞核骨骼肌细胞中，与感染、肥胖、缺氧、中毒有关。玻璃样变是指细胞内或间质中出现半透明状蛋白质蓄积，HE染色呈现嗜酸性均质状。分为细胞内玻璃样变，通常形成均质红染的圆形小体位于细胞质内；纤维结缔组织玻璃样变是纤维组织老化的表现，特点是胶原纤维增粗变宽其间少有血管和纤维细胞；细小动脉壁玻璃样变又称细小动脉硬化，脆性增加容易破裂出血。淀粉样变是指细胞间质内淀粉样蛋白质和黏多糖复合物蓄积，具有淀粉样染色形态。可见于甲状腺髓样癌等肿瘤的间质内。黏液样变是细胞间质内黏多糖（透明质酸、葡萄糖胺聚糖等）和蛋白质的蓄积。常见于间叶组织肿瘤、动脉粥样硬化斑块等。病理性色素沉着：含铁血黄素沉着是典型的一种，是巨噬细胞吞噬、降解红细胞血红蛋白所产生的铁蛋白微粒聚集体，是铁离子与蛋白质结合而成，镜下呈褐色颗粒。炎症(inflammation)是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所发生的以防御反应为主的基本病理过程。并非所有活体动物都能发生炎症反应，单细胞和多细胞生物对局部损伤发生的反应，例如吞噬损伤因子、通过细胞或细胞器肥大以应对有害刺激物等，这些反应均不能称为炎症。只有当生物进化到具有血管时，才能发生以血管反应为中心环节，同时又保留了上述吞噬和清除功能的复杂而完善的炎症反应。炎症是损伤、抗损伤和修复的动态过程，包括如下步骤(图4-1):①各种损伤因子对机体的组织和细胞造成损伤；②在损伤周围组织中的前哨细胞(例如巨噬细胞),识别损伤因子及组织坏死物，产生炎症介质；③炎症介质激活宿主的血管反应及白细胞反应，使损伤局部的血液循环中的白细胞及血浆蛋白渗出到损伤因子所在部位，稀释、中和、杀伤及清除有害物质；④炎症反应的消退与终止；⑤实质细胞和间质细胞增生，修复受损伤的组织。图、鼻窦黏膜标本HE染色图谱（来源Histology：A Text and Atlas：With Correlated Cell and Molecular Biology,9th 2023）以一名鼻窦炎患者的上颌窦黏膜活检标本为例，病例存在鼻腔和鼻窦的呼吸道黏膜的炎症。固有层明显增厚发生水肿，血管增大，并被淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞等免疫细胞严重浸润。该例组织的理论表达趋势应是呼吸上皮细胞和固有层结缔组织区域有明显表达检出，其中固有层可能主要是免疫细胞、成纤维细胞信号，而基底膜、骨膜区域则呈现极低表达。斑块是一种病理现象,通常是动脉粥样硬化的标志，意味着血管壁上的脂肪和钙质积累,形成硬块,这可能导致血流受阻,引发心脏病等疾病。组织钙化是组织在一些其他因素作用下发生坏死，钙盐会在组织内沉积。比较常见的甲状腺钙化，是在甲状腺上发现单个或多个结节，并发粗大或细沙样钙化灶，可能由炎症、血肿吸收机化或肿瘤血管或纤维组织增生引起。表现在空转表达上是斑块和钙化部位组织基因表达无检出。当组织具有肿瘤区域/纤维化/钙化等区域类型时，依据已有空转数据经验，表达高低分布是“肿瘤区域>纤维化>钙化区域”,高度纤维化及钙化区几乎无检测信号。因此，对于该类组织，空转的检测建议是在选片过程中，候选组织采用组织钙化比例有限的切片，且捕获区域尽量避开钙化区域。 图、乳头状甲状腺癌肿瘤基质钙化（来源：pathologyoutlines.com）图、深紫色部分是血管内膜的钙化（发生在动脉粥样硬化病变中，来源：NETTER'S ESSENTIAL HISTOLOGY）具有典型特征的肿瘤组织类型存在相应的表达特性。比如，黏液性癌症是一种恶性肿瘤的病理类型,通常被称为黏液癌，主要发生在胃和大肠。胃粘液腺癌以肿瘤组织中含有大量粘液为特征,呈巢状或团块状生长,癌细胞产生大量粘液样物质,并积存于癌巢中。该类组织，在黏液区域细胞密度低，胞质可能不甚清晰，几乎是不存在相应转录检出的。![]()
而一些溃疡类疾病，例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病或放射性改变;溃疡可使黏膜沿肉芽组织通道蔓延，并在黏膜下层形成黏液湖；该区域除没有表达信号以外，同时整片组织的核酸完整性可能受限，还可能影响周边细胞检出水平。 图、深在性囊性结肠炎大多数是由肠道炎症和溃疡所致（来源：罗塞和阿克曼外科病理学（第11版））图、Alport综合征。肾小球表现为局灶节段性硬化，间质有泡沫细胞浸润（PAS）来源：罗塞和阿克曼外科病理学（第11版）肾透明细胞癌也是一种典型的低表达分布肿瘤类型，其细胞质内的糖原和脂类在加工过程中被溶解，使细胞变得“透明”。肿瘤起源于肾皮质，80%为富血供肿瘤，肿瘤内常存在坏死、出血或钙化肾包膜。“透明”的癌细胞区域，细胞密度低，表达水平相较腺癌、鳞癌是偏低的。 图、肾细胞癌，透明细胞型（来源：罗塞和阿克曼外科病理学（第11版））上述示例肿瘤组织类型虽然表达相对偏低，但转录检出与其组织特性相符，因此，提示相应低表达风险并非是阻止该研究发生，而是在课题设计时增加相应环节的考量，比如辅助单细胞测序采用反卷积提高检测精度，增加检测病例数量做整体趋势分析，结合空间蛋白研究、免疫组化、多重免疫荧光染色等技术手段，作为转录组检测数据的补充和验证。
三、与组织特征无关但与组织采集制备保存相关的避雷点
本篇就先展示上述组织、病理特性相关的空转表达趋势特征，但要想获得更高质量的空间转录组数据样本采集准备也是至关重要的，对珍贵的临床样本而言，与其相关的雷点导致数据低质量是非常可惜的。因此，笔者也整理了相应避雷点，提供老师重点参考以规避风险。
脑组织作为空转典型的研究案例，呈现非常典型的高表达趋势，此处不做进一步展开阐释；仅提醒在脑组织取材过程中，避免未及时固定导致的细胞自溶现象。而肌肉、脂肪、皮肤、血管等则具备其特定的组织特征，并不能作为常规的案例进行默认的检测，建议慎重考虑研究目的及对象。 新鲜样本在冷冻包埋前会进行水分、血渍等去除/石蜡样本脱水环节，但如果过分干燥/脱水使组织细胞碎裂，收缩变形，发生不可逆的损伤。改进建议：对于FF样本，吸水纸轻轻吸去表面液体即可，无需反复擦拭，如果表面出现明显干燥，需避开区域选择；对于FFPE样本，根据样本特点合理优化脱水步骤，避免脱水过度导致的组织开裂。以肺组织为典型代表，易出现炭渣沉积，影响组织形态及部分核酸质控指标，沉积区域无响应表达。此外，组织存在大量血管、肺泡等管腔结构且残留的血液等液体，可能导致样本制备后切片中出现裂缝或杂质残留。尤其针对冰冻组织，管腔内液体的残留物不仅破坏组织切片形态，同时增加切片难度，出现区域破损，严重时导致整张组织无法成片。改进建议：尽量避开该区域表达检测/进行灌注冲洗去除液体残留。 图、组织出血区、裂痕区、含铁血黄素沉积，均将可能影响形影表达信号对于FF样本，由于在样本制备过程中，组织内水分在-60∽0℃形成冰晶刺破细胞，不仅破坏了切片完整性，同时也会造成单位面积内RNA含量也随之下降，结果显示为制片形态不佳、最终的RNA检测量偏低。冰冻组织在冷冻过程中会有冰晶产生并刺破细胞，在切片的时候外界温度升高，冰晶融化，会有这种空泡或者规律性白色空白条纹产生。容易产生冰晶的组织包括肌肉组织、肝脏的组织、膀胱的组织等，可考虑包埋前进行20%-50%蔗糖脱水。图、明显冰晶产生（小鼠脑组织OCT冰冻组织HE图）冰晶对空转检测的影响：冰晶刺破细胞，核酸泄露，在表达前的染色清洗过程可能大量损失游离出来的核酸，导致最终检测水平偏低。冰晶只能尽量避免，但无法完全规避。无法忍受冰晶干扰的老师，建议选择尝试多聚甲醛固定蔗糖脱水的冰冻组织包埋（FxF）或者石蜡包埋组织（FFPE）。我司尝试不同蔗糖脱水条件后验证核酸RIN无明显影响，组织形态限制明显降低冰晶影响。联川在空转转录组深耕至今，尤其作为HD高精度空转平台的首发服务商，积累了丰富的样本和数据经验，覆盖样本采集方向和各类型组织/病理方向的组织-数据相关性方向，愿我们的客户和未来客户能借助空间转录组这一利器获得更好的研究成果。
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