用户文章Cell Metab：ATAC与ChIP-seq揭示蛋氨酸调控甲基化与组蛋白修饰在肿瘤肌肉萎缩中作用

摘要

    在癌症恶病质期间，骨骼肌中的蛋氨酸循环受到干扰，导致内质网应激和DNA低甲基化诱导的DNA损伤应答转录本4(Ddit4)基因表达，该基因编码调控发育和DNA损伤响应1(REDD1)蛋白。

    通过抑制DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)来靶向DNA甲基化会加剧恶病质，而恢复DNMT3A表达或REDD1基因敲除则可减轻小鼠癌症恶病质诱导的骨骼肌萎缩。

    蛋氨酸补充恢复了DNMT3A依赖的Ddit4启动子的DNA甲基化，从而抑制激活转录因子4(ATF4)介导的Ddit4转录。因此，通过鉴定蛋氨酸/SAM/DNMT3A/DNA低甲基化-Ddit4/REDD1调控轴，该研究为癌症恶病质的表观遗传机制提供了分子生物学以及代谢水平的新见解，并表明营养补充是一种有希望预防或逆转恶病质肌肉萎缩的新治疗策略。

    首先作者建立了肿瘤诱导的恶病质小鼠模型，发现小鼠出现体重减轻等特征，肌肉和脂肪组织重量显著下降。

    靶向代谢组学分析显示肌肉中氨基酸代谢物积累，蛋氨酸水平总体增加，但代谢产物SAM下降，SAH上升，SAM/SAH比率显著降低，类似代谢功能障碍在恶病质患者肌肉中也被观察到。体外同位素追踪实验揭示C26条件培养基诱导细胞萎缩时蛋氨酸代谢异常。电镜显示恶病质小鼠骨骼肌线粒体萎缩和内质网功能障碍。

    Bulk ATAC-seq和转录组测序联合分析表明，与正常组相比，恶病质小鼠肌肉中Dnmt3a基因表达水平降低，Ddit4基因表达水平增加，且Dnmt3a与肌肉萎缩标志物呈负相关，Ddit4与这些标志物呈正相关，与肌肉收缩基因呈负相关。

    WB分析证实恶病质小鼠中REDD1蛋白水平增加，DNMT3A蛋白水平降低，在恶病质患者样本中也有类似结果，且恶病质肌肉中DNA甲基化降低与DNMT3A下调相关，同时MAT2A在小鼠和人类模型中均降低。

    利用AAV在BALB/c小鼠中过表达DNMT3A发现，恶病质进程中的体重损失现象以及小鼠右后肢的握力下降现象均得到了缓解。HE和laminin染色显示，DNMT3A过表达减少了骨骼肌萎缩，并通过增加肌肉横截面积（CSA）得到支持。此外，DNMT3A过表达还改善了肌肉降解标志物，包括泛素-蛋白酶体途径（UPP）和自噬途径。

    使用DNA甲基转移酶抑制剂5-Azacytidine（5-Aza）处理后，肿瘤小鼠的体重损失情况以及整体健康状况均出现恶化。5-Aza处理虽然对心脏和iWAT重量影响不显著，但限制了肿瘤生长，加剧了肌肉萎缩。

    H&E和laminin染色显示，5-Aza给药后肌肉萎缩显著加重。WB分析显示，在肿瘤诱导的恶病质背景下，5-Aza治疗增加了REDD1表达，并加剧了肌肉降解标志物的活性如增加了REDD1、MuRF-1和自噬蛋白LC3的表达，影响了体重、瘦肉质量和肌肉重量，但对iWAT、心脏和肿瘤重量影响不大。

    使用REDD1基因敲除的C57BL/6小鼠建立LLC移植诱导的肿瘤恶病质模型，验证了敲除策略。在REDD1KO小鼠中，LLC移植后骨骼肌降解显著改善，心脏和iWAT重量损失减少，肿瘤生长受到抑制，体重变化改善。HE染色证实肌肉萎缩改善，未观察到明显肌肉纤维化。

    WB显示Ddit4缺失改善了恶病质中的骨骼肌降解，降低了MuRF-1和LC3水平，恢复了PI3K-AKT途径的抑制，提高了MyHC表达水平，REDD1KO还显著恢复了恶病质诱导的肌肉MAT2A表达降低。

    用MethPrime甲基化预测网站发现Ddit4/DDIT4启动子区域存在大量CpG岛，并在自己课题组的样本上通过甲基化特异性PCR（MSP）实验得到了验证，即小鼠和临床患者的Ddit4/DDIT4启动子甲基化水平降低。过表达DNMT3A的恶性骨骼肌中甲基化增加，双硫酸盐测序PCR（BSP）进一步证实了启动子的甲基化变化。

    转录因子招募是基因转录的主要驱动因素，信号转导和转录激活因子3（STAT3）在肌肉中起重要作用，但抑制STAT3虽减轻肌肉萎缩，却不改变REDD1表达，且STAT3在Ddit4启动子的招募无显著变化。

    于是作者重新分析Bulk ATAC-seq数据，发现DNMT3A介导的DNA甲基化可能改变转录因子在Ddit4启动子的招募，ATF家族蛋白（ATF2和ATF4）motif 在开放染色质区域显著富集，且ATF2和ATF4在恶病质条件下显著上调。

    恶病质小鼠骨骼肌中内质网（ER）相关基因上调，证实存在ER应激，表现为相关蛋白激活，在C2C12肌管系统中，C26条件培养基也增加了ATF4表达及其向细胞核的转位，内质网激活剂衣霉素（TM）可模拟Ddit4和Atf4表达。

在HEK293细胞中过表达ATF4和用ATF4激活剂处理均上调REDD1表达，ChIP-PCR结果显示C26条件培养基刺激增加了ATF4和H3K27ac在Ddit4启动子的招募，SAMe补充可减弱此效应，DNMT3A过表达可防止恶病质激活或ER应激诱导的Ddit4表达。

    作者假设蛋氨酸补充可以改善肌肉功能。结果显示，蛋氨酸补充显著改善了恶病质进程中的体重损失，并显著增加了无肿瘤体重、肌肉质量和瘦体重，而心脏重量、iWAT质量和肿瘤重量没有明显变化。

    H&E和laminin染色显示蛋氨酸显著改善了肌肉萎缩。

    WB结果表明，蛋氨酸补充通过影响MuRF-1、atrogin-1和LC3来减轻肌肉萎缩。

    作者比较了SAMe、叶酸和甜菜碱补充对恶病质的效果。SAMe补充显著改善了恶病质引起的肌肉萎缩，并延缓了体重损失。靶向代谢组学分析表明，只有SAMe补充有效降低了升高的甲基代谢物水平，增强了DNMT3A表达，支持了肌肉中的DNA甲基化过程，减少了REDD1激活，改善了线粒体和内质网形态，缓解了ER应激，表现为相关蛋白表达水平的变化。

    SAMe还逆转了肌肉、心脏和瘦体重的组织损失，并对肿瘤生长和iWAT重量有轻微影响。

    H&E和laminin染色显示，SAMe补充后肌肉萎缩显著改善。WB结果表明，SAMe补充通过影响MuRF-1和LC3表达来减轻肌肉萎缩，并逆转了REDD1的抑制。

讨论与总结

    本研究揭示了蛋氨酸稳态在癌症恶病质诱导的肌肉萎缩中的关键作用。

    研究发现，在癌症恶病质诱导的肌肉萎缩过程中，蛋氨酸代谢显著失调，其作为甲基供体在调控Ddit4的表观遗传机制中发挥重要作用，为治疗肌肉萎缩提供了新的营养策略视角。

    线粒体在肌肉中扮演着能量调节的关键角色，而蛋氨酸循环功能障碍引发的甲基供体缺乏（SAM）对DNMT3A表达和Ddit4启动子DNA低甲基化至关重要，进而导致ER应激激活ATF4并触发REDD1过表达，抑制mTOR并抑制AKT激活，最终引起线粒体功能异常、自噬和肌肉萎缩相关基因表达异常。

    研究还发现，蛋氨酸或SAMe补充有望减轻癌症恶病质诱导的肌肉萎缩，而叶酸和甜菜碱补充效果不显著，可能与其在体内转化为甲基供体的途径差异有关。

    尽管研究取得了重要发现，但仍存在一些局限性，如对蛋氨酸驱动的DNMT3A/REDD1调控轴在肌肉生理中的更广泛意义有待进一步研究，且主要依赖小鼠模型，需仔细审视关键机制在小鼠与人类间的保守性。

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