中科院广州健康院赖良学组 | 受精卵RNA或DNA显微注射
学术
科学
2024-12-22 09:01
北京
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Bio-101是Bio-protocol旗下的中文生命科学实验方案共享平台。通过与四百多个国内优秀课题组合作，以及上千名专家的共同努力，平台已出版九本高质量、同行评审、开放获取的中文实验方案电子手册，促进了中国科研人员之间的交流与合作。每周末，小bio将与大家分享其中的文章，本次是中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学团队的题为“受精卵RNA或DNA显微注射”的方法文章。
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将RNA或者DNA注射入受精卵，对受精卵基因组进行基因修饰后再移植代孕受体，可获得基因修饰的个体。关键词：受精卵注射 基因修饰
2. 1.0 mm × 0.6 mm玻璃管（WPI） 5. TCM-199（Gibco，catalog number: 11150-059） 6. NaHCO3（Sigma，catalog number: S4019） 7. Hepes（Sigma，catalog number: H3784） 8. Penicillin（Sigma，catalog number: P3032） 9. Streptomycin（Sigma，catalog number: S1277） 10. NaCl（Sigma，catalog number: S5886） 11. H2O（Sigma，catalog number: W-1503） 12. KCl（Sigma，catalog number: P-4504） 13. KH2PO4（Sigma，catalog number: P-5655） 14. MgSO4·7H2O（Sigma，catalog number: M-1880） 15. Na-Pyruvate（Sigma，catalog number: 4562） 16. Ca.(Lactate)2·5H2O（Fisher，catalog number: C110-500） 17. L-Glutamine（Sigma，catalog number: G-7029） 18. Hypotaurine（Sigma，catalog number: BH-1384） 19. NEAA（Sigma，catalog number: M7145） 20. EAA（Sigma，catalog number: B-6766） 21. Gentamicin （Gibco，catalog number: 15710-064） 22. BSA（Sigma，catalog number: A8022） 6. 显微操作系统（NIKON-NT-88-V3）1. 将取冲得到的受精卵在操作液中洗 3 次，放入操作液备用。2. 在60 mm皿的皿盖中央区域做几个去核操作液液滴，并用石蜡油覆盖，用于胞质注射。3. 将制备好的的RNA 从-80 °C取出，使用 DEPC 水将 RNA 分别稀释成合适浓度，如CRIRSPR/CAS9系统进行基因敲除，Cas9 浓度为200ng/μl和 sgRNA浓度为20 ng/μl。4. 用无RNA 酶的枪头将RNA注入注射针中，将固定针和注射针安装到显微操作仪上，将40-60 个受精卵移入操作滴中。用固定针吸住受精卵，将极体调整到6或者12点钟方向。注射针穿破透明带和质膜进入胞质，将RNA注射入胞质，用注射泵对每个胚胎注 2-10 pl 的RNA，注射后受精卵有明显臌胀。若注射物为DNA则将DNA注射入雄原核。5. 注射完的受精卵在胚胎培养液中洗 3 次放入 38.5 °C、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。6. 发育到囊胚后，收集胚胎，对目的基因进行鉴定。受精卵注射后，发育到囊胚后对基因修饰效果进行鉴定。CRISPR/Cas9系统进行基因打靶，依据基因和位点的不同，基因修饰效率在10%-100%不等1. 注射DNA或者RNA的浓度会影响胚胎发育。通过设置浓度梯度，对浓度进行优化，筛选出既不影响胚胎发育又可以对受精卵基因组进行有效修饰的浓度。2. DNA和RNA需要瞬时离心以去除杂质，避免注射时堵塞注射针。9.500 g TCM-199（Gibco，11150-059）0.050 g NaHCO3 (Sigma，S4019)0.750 g Hepes (Sigma，H3784)0.050 g Penicillin（Sigma，P3032）0.060 g Streptomycin（Sigma，S1277）1.755 g NaCl（Sigma，S5886）3.00 g BSA （Sigma, A8022）1000 mL Milli Q H2O，溶解后调节PH为7.2-7.4溶解后调节PH为7.2-7.4，渗透压为295-310 mOsm。108.00 mM NaCl（Sigma，S-5886）0.35 mM KH2PO4（Sigma，P-5655）0.40 mM MgSO4·7H2O（Sigma，M-1880）25.07 mM NaHCO3（Sigma，S-8875）0.2 mM Na-Pyruvate（Sigma，4562）2.0 mM Ca.(Lactate)2·5H2O（Fisher，C110-500）1.0 mM L-Glutamine（Sigma，G-7029）5.0 mM Hypotaurine（Sigma，H-1384）10 ml/L NEAA（Sigma，M7145）20 mg/mL EAA（Sigma，B-6766）0.05 mg/mL Gentamicin （Gibco，15710-064）1. 感谢国家重点研发计划“干细胞与转化研究”专项提供经费支持。2. 已发表的使用本实验方案的文章“Highly Efficient Generation of GGTA1 Biallelic Knockout Inbred Mini-Pigs with TALENs”1. Wang, Y., Fan, N., Song, J., Zhong, J., Guo, X., Tian, W., Zhang, Q., Cui, F., Li, L., Newsome, P. N., Frampton, J., Esteban, M. A. and Lai, L. (2014). Generation of knockout rabbits using transcription activator-like effector nucleases. Cell Regen 3(1): 3.2. Yan, Q., Zhang, Q., Yang, H., Zou, Q., Tang, C., Fan, N. and Lai, L. (2014). Generation of multi-gene knockout rabbits using the Cas9/gRNA system. Cell Regen 3(1): 12.3. Wang, X., Cao, C., Huang, J., Yao, J., Hai, T., Zheng, Q., Wang, X., Zhang, H., Qin, G., Cheng, J., Wang, Y., Yuan, Z., Zhou, Q., Wang, H. and Zhao, J. (2016). One-step generation of triple gene-targeted pigs using CRISPR/Cas9 system. Sci Rep 6: 20620.樊娜娜, 欧阳振, 王教伟, 张全军, 赖良学. (2022). 受精卵RNA或DNA显微注射. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010965. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010965.
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