上海交大杨选明组 | 嵌合抗原受体T细胞体外肿瘤杀伤的流式检测
学术
科学
2024-12-21 09:03
北京
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Bio-101 是 Bio-protocol 旗下的中文生命科学实验方案共享平台。通过与四百多个国内优秀课题组合作，以及上千名专家的共同努力，平台已出版九本高质量、同行评审、开放获取的中文实验方案电子手册，促进了中国科研人员之间的交流与合作。每周末，小bio将与大家分享其中的文章，本次是上海交通大学生命科学技术学院杨选明团队的题为“嵌合抗原受体T细胞体外肿瘤杀伤的流式检测“的方法文章。
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嵌合抗原受体T细胞 (CAR-T)，是通过基因工程手段进行修饰的T细胞。胞外区含有不受MHC限制的单链可变区 (scFv)，可特异识别抗原 (如CD20等)；胞内区含有共刺激结构域 (CD28，4-1BB等) 和第一信号激活结构域 (CD3ζ)，进行信号传递 (Eshhar等，1993；Sadelain等，2013)。CD20 CAR-T可特异的识别并杀伤表达CD20的人B淋巴瘤细胞系Raji (Kowolik等，2006)。在体外，CD20 CAR-T与靶细胞Raji以不同比例共培养24小时，使用不同抗体分别标记CAR-T细胞和靶细胞，通过流式细胞技术确定CD20 CAR-T杀伤功能。关键词：CAR-T 靶细胞 流式细胞技术 T细胞杀伤
1. 96孔板 (U型) (Jet Biofil, catalog number: 011096) 2. Falcon细胞流式管 (BD, catalog number: 352054) 3. 离心管 (Jet Biofil, catalog number: CFT011550) 4. Raji 细胞 (ATCC® CCL-86TM) • APC-anti-human CD19 (BioLegend, catalog number: 302212) • FITC-anti-human CD3 (BioLegend, catalog number: 317306) 6. 胎牛血清 (FBS) (Gibco, catalog number: 10270) 7. RPMI 1640培养基 (Hyclone, catalog number: SH30809.01) 8. Penicillin/streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010) 9. 台盼蓝 (Trypan Blue) (Sigma-Aldrich, catalog number: T8154) 10. β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol) (Amresco, catalog number: 0482) 11. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900058-500g) 12. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900068-500g) 13. Na2HPO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900060-500g) 14. KH2PO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900041-500g) 15. Na3N (Amresco, catalog number: 0639-250g) 16. IL-2 (北京四环生物制药有限公司，catalog number: 国药准字S10970018) 18. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方) 19. FACS buffer (1 L) (见溶液配方)1. 流式细胞仪 (Beckman Coulter, model: Cytoflex S) 2. 电动吸引器 (斯曼峰，model: YX930D) 4. 正置光学显微镜 (Olympus, model: IX2-SLP) 5. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R) 6. 医用低温保存箱 (海尔，model: DW-25L262/BD-226W) 8. 生物安全柜 (LabGard, model: Class II/Labconco) 9. 天平 (Sartorius, model: BSA124S) 10. 高压灭菌锅 (上海博迅实业有限公司，model: YXQ-LS-100S11)1. 分别收集悬浮细胞Raji、对照T细胞 (未进行基因修饰原代T细胞)、CD20 CAR-T细胞 (能特异识别CD20的嵌合抗原受体T细胞) 到50 ml离心管，取10 μl细胞，加入10 μl台盼蓝 (可根据细胞浓度进行适当稀释)，计数；2. 500 x g离心5 min，弃去上清，新鲜T细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度 (Raji 2 × 106/ml，对照T细胞或CD20 CAR-T 1 × 106/ml)；3. 按照不同的比例将Raji (Target cells) 和对照T细胞、CD20 CAR-T (Effector cells)混合于96孔培养板 (平底型)，总体积至200 μl，置于37 °C，5% CO2培养箱进行E:T = 1:0.5 (1 × 105/100 μl CD20 CAR-T + 5 × 104/25 μl Raji +75 μl T培养基)E:T = 1:1 (1 × 105/100 μl CD20 CAR-T + 1 × 105/50 μl Raji + 50 μl T培养基)E:T = 1:2 (1 × 105/100 μl CD20 CAR-T + 2 × 105/100 μl Raji);4. 24小时，混匀细胞，取100 μl细胞加入96孔板 (U型)，进行流式检测；5. 加入150 μl FACS buffer，500 x g离心3 min，弃去上清；6. 抗体准备 (以下为单个样品)：50 μl FACS buffer + 0.03 μg FITC-anti-human CD3 + 0.0075 μg APC-anti-human CD19;7. 将已配制抗体加入样品中，50 μl/样品，移液枪混匀，4 °C避光孵育25 min；8. 加入150 μl FACS buffer洗去未结合抗体，500 x g，离心3 min，弃去上清；10. 70 μl FACS buffer重悬样品，将样品置于冰上；1. 人淋巴瘤细胞Raji表达CD19，CD20等抗原，为了规避CD20 CAR-T与anti-human CD20竞争性结合CD20位点，使用anti-human CD19抗体进行肿瘤特异性标记。
2. FSC-A和SSC-A排除死细胞和细胞碎片，确定和收集主要细胞群 (Gate 1，收集10,000个数据点/样品) (图1)。3. 通过CD3 (FITC-A) 和CD19 (APC-A) 分别分析T细胞和Raji细胞。4. 与未进行基因修饰T细胞相比，随着E:T比例降低，残留靶细胞Raji比例逐渐增加，但是与对照T细胞相比，CD20 CAR-T仍表现出较强的杀伤能力，T cell only和Raji only作为染色的对照。
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图1. CAR-T细胞体外杀伤流式检测
1. 对于不同肿瘤细胞的CAR-T杀伤实验，可根据肿瘤自身的抗原表达特点，选取不同的表面分子进行流式分析，以达到区分肿瘤细胞和T细胞的目的，对于选择的抗体也应进行用量滴定，保证最佳的细胞分群效果。
2. 若肿瘤细胞表达较高FcγR导致抗体非特异结合，应在染色体系中包含FcγR blocker。3. 对于某些肿瘤杀伤较慢，可延长杀伤时间至48小时或72小时。1. 10× PBS (1 L, pH = 7.3)
使用分析天平精准称量上述试剂，加入800 ml ddH2O依次进行溶解，待所有试剂完全溶解后，加入ddH2O定容至1 L，高温湿热灭菌，冷却后室温保存待用
使用量筒取100 ml 10× PBS，首先加入800 ml ddH2O进行稀释，再加入10 ml FBS和2.5 ml Na3N (20%)，混合均匀，加入ddH2O定容至1 L，4 °C备用L-Glutamine (200 mM) 6 ml Penicillin/streptomycin 5 ml感谢杨选明实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (81671643)、科技部重点研发计划 (2016YFC1303400) 资助。
1. Eshhar, Z., Waks, T., Gross, G. and Schindler, D. G. (1993). Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 90(2): 720-724.2. Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., Pfeiffer, T., Olivares, S., Gonzalez, N., Smith, D. D., Forman, S. J., Jensen, M. C. and Cooper, L. J. (2006). CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res 66(22): 10995-11004.3. Sadelain, M., Brentjens, R. and Rivière, I. (2013). The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov 3(4): 388-398.张晓卿, 杨选明. (2019). 嵌合抗原受体T细胞体外肿瘤杀伤的流式检测. Bio-101: e1010316. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010316.
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