血浆和肿瘤组织的多组学分析揭示了三阴性乳腺癌抗PD-L1免疫治疗的核心蛋白

hello呀 各位bro and sis，看到这个开场白，你们就知道今天是我来share文献了，我还是我，又练肌肉又学科研的废柴儿科医生。

最近呢，身份的转换让我有点疲惫不堪啊。已经不是临床牛马医生了，做起了实验，为了💦学位啊。我走出了和临床医生晋升体系不同的一步，属于是给大家探探路了。但是也有一些问题，由于自己实验的短板，还是被老板嫌弃了，属实是emo了一段时间啊，他们不喜欢bioinformatics，只喜欢实验，而且呢还被实验室的被刺了，属实是见过世面了，学术妲己本己了。好了，言归正传，今天我们来分享一个文献。

文章信息：

文章题目：Proteomic, single-cell and bulk transcriptomic analysis of plasma and tumor tissues unveil core proteins in response to anti-PD-L1 immunotherapy in triple negative breast cancer
发表期刊：Computers in Biology and Medicine （这一点我确实是没想到，是一个computer的杂志，那我们是不是也属于computer science了？？）
DOI：10.1016/j.compbiomed.2024.108537
发表时间：2024年4月
发表单位：哈尔滨医科大学（属实是生信领域的大牛单位了）
样本类型：涉及了16位接受免疫疗法的TNBC患者，收集了他们的血浆样本，并进行了质谱分析。还结合了公共数据库的分析

背景知识：

TNBC是一种具有高度侵袭性的乳腺癌亚型，患者对传统化疗的耐药性较高。免疫检查点抑制剂（ICB），特别是PD-1/PD-L1抗体，已被证明能显著改善TNBC患者的治疗效果。然而，并不是所有患者对该类治疗产生良好反应，研究旨在识别与治疗反应相关的生物标志物并研究潜在的耐药机制。

研究设计：

• 通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）和TMT定量方法分析接受化疗或化疗联合atezolizumab（抗PD-L1抗体）治疗的TNBC患者的血浆蛋白质表达变化。随后利用NSCLC和黑色素瘤患者的公开蛋白质组数据来验证发现。为了更全面地揭示蛋白质来源，研究结合了TNBC患者血液和肿瘤组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，进一步验证了与免疫治疗反应相关的蛋白质在多个癌症类型中的预测价值。
• 研究采用了LC-MS/MS质谱分析，使用TMT标记方法进行蛋白质定量，并通过随机森林模型分析蛋白质表达差异。结合单细胞RNA测序和批量RNA测序数据，研究识别了与免疫治疗反应相关的核心蛋白质。具体步骤包括：
• 收集16例TNBC患者的血浆样本，分为单独化疗和化疗联合免疫治疗两组。
• 利用TMT标记分析血浆样本中的蛋白质组，筛选出634个符合质量控制标准的蛋白质。
• 利用随机森林模型识别出FAP、COMP、LBP和LRG1四个与免疫治疗响应相关的核心蛋白质。
• 使用公开数据对这些蛋白质进行了验证，并通过通路富集分析和蛋白-蛋白相互作用分析进一步探索这些蛋白质的功能和潜在作用机制。

是不是稍微有些复杂了？复杂就对了，不然咋发一区文章啊

Figure1

• 图A展示了研究的实验设计。研究将TNBC患者分为两组：一组接受Atezolizumab（抗PD-L1抗体）联合Paclitaxel治疗，另一组仅接受Paclitaxel治疗。实验采集了治疗前（D0）、治疗第7天（D7）和第一个治疗周期后的血样（M1），用于进行TMT定量蛋白质组学分析。图中的实验设计还展示了对患者治疗反应（如完全缓解CR、部分缓解PR、稳定病情SD、进展病情PD）的观察。
• 图B展示了参与研究患者的临床特征，包括年龄、治疗反应（NR为无反应，R为有反应）、PD-L1评分、肿瘤转移部位等。不同颜色的条表示不同的临床变量，这些变量被用来探索与治疗反应之间的关系。PFS（无进展生存期）在不同治疗组之间也进行了比较。
• 图C展示了在各个治疗周中，不同患者群体相对于基线的靶病变变化百分比。可以看出，Atezolizumab联合Paclitaxel治疗组（红色线条）和单独Paclitaxel治疗组（蓝色线条）在治疗反应上有显著差异。联合治疗组的反应较为积极，靶病变的缩小幅度更大，尤其在反应者（R）中表现更为明显。
• 图D展示了PD-L1联合治疗组和单独化疗组的PFS比较，两组之间没有显著差异。
• 图E则对比了不同治疗组中有反应者（R）和无反应者（NR）的生存率，可以看出，PD-L1治疗组的反应者生存期显著优于无反应者，提示PD-L1可能对部分患者有更长久的生存获益。
• 图F展示了在PD-L1联合治疗组和单独化疗组中，不同时间点血小板计数（PLT）的变化情况。结果表明，PD-L1治疗组的反应者（R）在治疗过程中血小板计数有所增加，提示血小板计数可能与免疫治疗反应相关。

Summary：

• 研究者通过对TNBC患者的临床特征和血浆蛋白质组的分析，揭示了抗PD-L1治疗与患者治疗反应的潜在联系。
• 联合治疗组在反应者中显示了显著的靶病变缩小和生存期延长，血小板计数的增加可能与免疫治疗反应相关。
• 为进一步探索抗PD-L1治疗在TNBC中的应用提供了理论支持，并指出了潜在的生物标志物（如血小板计数）可以用于预测治疗反应。

Figure2

• A：展示了差异表达蛋白（DEPs）的分布情况，分别在D0、D7和M1时点。图中红色和蓝色分别表示在反应者（Responders）和无反应者（Non-responders）中显著上调或下调的蛋白质。可以看出，在不同时间点，某些蛋白质的表达变化显著，其中如S100A8、COMP等蛋白质在不同的时间点显示出不同的表达模式，提示它们可能与治疗反应有关。
• B：GOBP（生物学功能）的网络图，展示了D0时点差异表达蛋白在生物学功能中的富集情况。图中节点表示不同的生物学过程，边代表这些过程之间的关联。可以看到差异表达蛋白主要富集于急性炎症反应和免疫相关通路上，提示免疫反应在TNBC患者的治疗中发挥重要作用。
• C：展示了基因集富集分析（GSEA）在GOBP和Reactome数据库中的通路富集结果，分别在D0、D7和M1三个时间点。可以看到，免疫反应相关的通路如补体级联（Complement activation）、急性期反应（Acute-phase response）在反应者中富集，而在无反应者中富集的是细胞外基质（ECM）相关的通路，提示这些通路在不同患者的治疗反应中发挥不同作用。
• D：展示了在GSEA的核心基质通路（Core Matrisome pathway）中的基因富集情况，可以看到无反应者在该通路中的富集显著，而反应者的富集程度较低，进一步验证了ECM蛋白质在免疫治疗中的作用。
• E：总结了在不同时间点发现的共同差异表达蛋白（CoDEPs）和后续差异表达蛋白（Post-CoDEPs）。在D0、D7和M1三个时间点，FAP、COMP、LBP等蛋白质都被列为共同差异表达蛋白，提示这些蛋白可能是免疫治疗反应的关键预测因子。

Summary：

• Figure2分析了TNBC患者在免疫治疗过程中不同时间点的蛋白质表达变化，揭示了补体级联和ECM蛋白在治疗反应中的重要作用。
• 补体级联的激活与治疗反应呈正相关，而ECM蛋白质的高丰度与治疗反应呈负相关。
• 通过差异蛋白的富集分析，确定了FAP、COMP等蛋白质作为潜在的治疗反应标志物。

Figure3

• A：展示了PD-L1治疗组（D0时点）的热图，显示了在反应者和无反应者中的差异表达蛋白（DEPs）。每个患者样本的蛋白质表达水平通过颜色梯度（从红色到蓝色）表示，红色表示上调，蓝色表示下调。可以看到，反应者和无反应者在一些关键蛋白的表达上有明显差异，这些蛋白可能是预测免疫治疗效果的潜在生物标志物。
• B：展示了基于随机森林模型的特征重要性分析。图中显示了随机森林模型选择的最重要的变量，按“平均精度下降”（MeanDecreaseAccuracy）进行排名。FAP、LBP、LRG1和COMP等蛋白质在预测TNBC患者对PD-L1免疫治疗的反应中起到了重要作用，表明这些蛋白是治疗反应的核心预测因子。
• C：展示了随机森林模型的受试者工作特征（ROC）曲线，用于评估模型在训练集中的表现。曲线下面积（AUC）接近1，表示该模型对反应者和无反应者的分类具有较高的准确性。
• D：展示了基于随机森林模型对TNBC患者的验证结果。横坐标是预测无反应值，纵坐标是蛋白质的平均表达水平。图中显示，反应者和无反应者的预测值有明显差异，表明该模型能有效区分TNBC患者的治疗反应。
• E&F：展示了将随机森林模型应用于NSCLC患者（分别是D0时点和D7+M1时点）的验证结果。四个关键蛋白（FAP、LBP、LRG1和COMP）也在NSCLC患者中显示出类似的预测能力，进一步证明了这些蛋白质在不同癌症类型中对免疫治疗反应的预测价值。
• G：展示了FAP、LBP、LRG1和COMP四个蛋白在不同治疗组中的分布情况。左图显示了化疗组的反应者和无反应者（Chemo R和Chemo NR）的差异，中间和右图分别显示了PD-L1治疗组反应者和无反应者在不同时间点的分布情况。可以看到，这四个蛋白的表达模式在PD-L1治疗组和化疗组中表现出不同的趋势，表明它们在预测免疫治疗反应中的特异性。

Summary：

• 整个Figure 3通过随机森林模型识别了FAP、LBP、LRG1和COMP四个核心蛋白，它们在TNBC和NSCLC患者中均能有效预测免疫治疗的反应。该模型在区分反应者和无反应者方面表现出较高的准确性，提示这些蛋白质可能是免疫治疗效果的可靠生物标志物，具有重要的临床应用潜力。

Figure4

• A：展示了四个核心蛋白（FAP、LBP、LRG1、COMP）在不同时间点（D0, D7, M1）的相互相关性。每个圆饼图展示了两个蛋白之间的相关性，颜色的深浅表示相关性强度，蓝色表示正相关，红色表示负相关。可以看到，FAP和COMP在所有时间点上始终保持高度正相关，而FAP和LBP、LRG1则显示出负相关。这表明这些蛋白质可能通过相互作用调控患者对免疫治疗的反应。
• B：展示了核心蛋白（FAP、LBP、LRG1、COMP）与免疫反应相关蛋白之间的Spearman相关性分析。圆圈的大小和颜色表示相关性的大小和方向。图中标出了S100A8/9和PNP与FAP、COMP的负相关性，表明在接受PD-L1免疫治疗后，FAP和COMP可能抑制了免疫反应的活性。
• C：展示了核心蛋白在整个免疫应答通路中的作用，通过不同颜色块表示这些蛋白在不同免疫途径中的富集情况。红色表示上调，蓝色表示下调。通过与免疫相关通路的相关性分析，可以看到，FAP、COMP、LRG1和LBP与多个免疫调节通路显著相关，尤其是在补体级联、急性期反应和细胞因子信号通路中。
• D：继续展示了这些蛋白在补体系统中的相关性。图中可以看到，FAP和COMP与补体C3、C5等蛋白的负相关性较强，进一步验证了补体系统在反应者中的激活情况。补体系统的激活与反应者对免疫治疗的正反应有关，而FAP和COMP的高表达则可能抑制补体的激活，影响治疗效果。
• E：展示了SOD1蛋白在反应者（R）和无反应者（NR）中的差异表达情况，以及FAP、COMP、LBP、LRG1四个蛋白与SOD1的关联。SOD1与FAP、LRG1、LBP显著相关，尤其是在M1时间点，这一结果表明SOD1可能在免疫治疗的过程中作为关键的调控因子。表格中的LogFC和P值显示了SOD1在不同时间点的表达变化，其中M1时点的表达显著上调，提示它可能在免疫治疗反应中发挥重要作用。

Summary：

• 整个Figure 4通过分析FAP、LBP、LRG1和COMP四个核心蛋白与免疫系统和补体系统相关蛋白的相互作用，揭示了这些蛋白在调控免疫治疗反应中的潜在机制。FAP和COMP可能通过抑制补体系统和免疫反应来阻碍治疗效果，而SOD1则作为一个重要的免疫调节蛋白，可能在促进治疗反应中起到关键作用。

Figure5

• A：展示了免疫治疗反应者（Responder）和无反应者（Non-responder）在不同时间点的蛋白质表达变化。通过Mfuzz聚类算法，研究将差异表达蛋白（DEPs）根据它们的表达模式分为不同的群集（Cluster），每个群集代表一种蛋白质在不同治疗时间点的表达变化趋势。
• 左侧的折线图显示了每个群集中蛋白质在反应者和无反应者中的表达趋势，红色表示反应者，蓝色表示无反应者。可以看到，反应者和无反应者在不同时间点的蛋白表达变化模式存在显著差异，尤其是补体激活、急性期反应、细胞外基质重塑等相关通路在反应者中的上调，说明这些通路可能在免疫治疗反应中发挥关键作用。
• 热图（中间部分）展示了这些差异蛋白在反应者和无反应者中的表达水平，绿色代表下调，红色代表上调。可以明显看到，在反应者中与补体系统、急性期反应和免疫反应相关的蛋白质在治疗后显著上调，而无反应者中细胞外基质相关蛋白的表达则有所增加。右侧的通路富集分析进一步将这些蛋白质归纳为不同的生物学功能通路。补体激活、急性期反应、细胞外基质重塑等是免疫治疗反应者中显著富集的通路，而无反应者中则更多富集了与血液凝固、创伤愈合相关的通路。
• B：展示了各个蛋白质群集中的蛋白质相互作用网络（PPI网络）。通过对每个群集的蛋白质进行相互作用分析，构建了不同群集中的蛋白质网络，颜色表示蛋白的p值大小，节点大小则表示蛋白质的成员得分（membership score），代表该蛋白在群集中的核心程度。
• 每个群集（C1到C10）的网络图显示了这些蛋白质如何通过相互作用形成功能性通路。例如，C1、C2、C3群集中补体系统相关的蛋白质显示了较强的相互作用，而C4到C10中的蛋白则更多参与了细胞外基质的组织和重塑。这些网络中的相互作用和功能通路进一步揭示了在免疫治疗中的分子机制。

Summary：

• 整个Figure 5通过将差异表达蛋白按其动态变化模式进行聚类，并结合通路富集和蛋白质相互作用网络，揭示了TNBC患者在接受PD-L1免疫治疗后的不同分子机制。研究发现，补体激活和急性期反应在反应者中显著上调，而细胞外基质相关的蛋白在无反应者中富集，提示这些通路在免疫治疗响应中的重要性。这些发现为进一步研究TNBC患者对免疫治疗的反应机制提供了新的线索。

Figure6

• A：展示了在PD-L1治疗组和化疗组的反应者（R）和无反应者（NR）在不同时间点（D7和M1）的差异表达蛋白（DEPs）的log2 fold change (FC)值。图中每个点代表一个蛋白质，横坐标表示不同时间点和治疗组，纵坐标表示蛋白质的log2 fold change。可以看到，在反应者和无反应者之间，某些蛋白的表达模式显著不同。例如，COMP、APOC3等蛋白在无反应者中显著上调，而在反应者中则相对下调，这些蛋白可能与免疫治疗的反应性相关。
• B展示了基因集富集分析（GSEA）在免疫反应通路和补体级联通路中的差异。上图显示了在PD-L1治疗的反应者中，免疫反应通路显著富集，而在无反应者中该通路的激活较弱。下图展示了补体级联通路的富集情况，反应者显示出更强的补体级联激活，而无反应者则相对较弱。这进一步验证了补体系统在免疫治疗反应中的关键作用。
• C：展示了在反应者和无反应者中的差异表达蛋白的比较。左侧的散点图分别展示了D7和M1时间点的log2 fold change，并通过上下对比反映了治疗前后的变化。右侧的表格列出了反应者和无反应者在不同时间点的显著差异表达蛋白。反应者中显著上调的蛋白包括FBLN2、MRC2等，而COL6A3、ICOSLG等蛋白在无反应者中上调。值得注意的是，UBA52在无反应者中表现出显著的下调，这表明它可能在免疫治疗反应过程中具有重要作用。
• D：进一步比较了D7和M1时间点的差异表达蛋白，特别关注反应者和无反应者的对比。图中的散点图和表格显示了在D7和M1时间点显著差异的蛋白质。例如，在M1时间点，UBA52和APOC2在无反应者中显著下调，而CLU和TNFRSF1B等在反应者中上调。这些蛋白质可能在调控患者对免疫治疗的反应中起到关键作用。

Summary：

• Figure 6通过展示差异表达蛋白在不同时间点的变化，揭示了反应者和无反应者在免疫治疗过程中的分子差异。补体级联、免疫反应通路以及某些特定蛋白（如UBA52、COL6A3、ICOSLG）在反应者和无反应者中的表达差异表明，这些蛋白质可能是预测免疫治疗效果的重要生物标志物，并且可能在治疗过程中调控免疫反应的强度。

Figure7

• A&B：展示了GSE169246数据集中的UMAP图，用于展示三阴性乳腺癌（TNBC）患者的血液和肿瘤样本中的细胞群体分布。图A显示了不同的细胞类型标记（如T细胞、B细胞、单核细胞等）的UMAP，图B则展示了这些细胞群体的进一步分类，可以看到肿瘤微环境中的不同免疫细胞群体的分布。
• C：展示了特定蛋白质（如APOE、APOC1、FAP等）在不同细胞类型中的表达情况。dotplot图显示了每个蛋白在不同细胞群体中的表达百分比和平均表达水平。可以看出，APOE和APOC1在单核细胞和巨噬细胞中有较高的表达，而FAP在成纤维细胞中表现显著，这表明这些蛋白质可能在不同细胞类型中具有不同的功能角色，尤其是在TME中。
• D：展示了APOC1和APOE在肿瘤组织和血液中的表达差异，可以看到，APOC1和APOE在肿瘤组织中的表达显著高于血液中的表达，尤其是在巨噬细胞中，这进一步表明这些蛋白质在TME中的重要性，可能与免疫抑制相关。
• E&F：E展示了GSE161529和GSE176078数据集的UMAP，显示了不同肿瘤细胞类型的分布。可以看到，成纤维细胞、内皮细胞、肿瘤细胞和免疫细胞在肿瘤微环境中的分布。图F则展示了不同细胞类型中关键蛋白的热图，进一步揭示了这些蛋白质在肿瘤微环境中的表达情况。FAP、COL6A1等ECM相关蛋白在成纤维细胞中的高表达提示它们在肿瘤微环境重塑中的重要作用。
• G：进一步展示了不同CAF（癌症相关成纤维细胞）亚群的UMAP，表明不同的成纤维细胞亚群在肿瘤微环境中的分布。不同颜色的标记代表了不同的CAF亚群（如FAP+ CAF、COMP+ CAF等），提示了这些亚群可能具有不同的功能作用。
• H：展示了这些CAF亚群中特定蛋白质的表达情况。dotplot显示了每个蛋白在不同CAF亚群中的表达百分比和平均表达水平。COMP、FAP、PLA2G2A等蛋白在不同CAF亚群中的表达差异显著，提示它们在CAF功能中的特异性作用，可能与肿瘤免疫逃逸相关。
• I：展示了不同CAF亚群之间的配体-受体相互作用网络。不同颜色的线表示不同CAF亚群之间的相互作用，图中的交互网络展示了FAP+ CAF与其他CAF亚群（如COMP+ CAF和PLA2G2A+ CAF）之间的信号通路。这些相互作用可能在肿瘤免疫调节中起重要作用，尤其是通过TGF-β、WNT等信号通路对肿瘤免疫微环境的调控。

Summary：

• 整个Figure 7通过对不同肿瘤微环境中的细胞群体进行单细胞RNA测序分析，揭示了特定蛋白质（如APOE、FAP、COMP等）在不同细胞类型中的表达特征。尤其是不同CAF亚群之间的配体-受体相互作用，提示了CAF在调控肿瘤免疫逃逸中的重要作用。

Figure8

• A：展示了TCGA-BRCA（乳腺癌）和Metabric数据集中FAP和COMP双高（high）与双低（low）患者的生存分析。Kaplan-Meier曲线表明，在这两个数据集中，FAP和COMP高表达的患者（红色曲线）的总生存期（OS）显著低于低表达患者（蓝色曲线）。这表明FAP和COMP的高表达与乳腺癌患者的不良预后相关，提示它们可能作为预后标志物在乳腺癌的诊断和治疗中具有潜在应用价值。
• B：展示了FAP与其他几个关键基质相关蛋白（如COMP、COL6A3、CD93、SIGLEC-15）之间的相关性分析。图中每个点代表一个患者样本，横坐标是FAP的表达值，纵坐标是相应蛋白的表达值，黄线表示线性拟合的趋势线。可以看到，在TCGA-BRCA和Metabric数据集中，FAP与COMP、COL6A3、CD93、SIGLEC-15的表达显著正相关（R值都大于0.5，且p值均显著）。这表明FAP可能通过与这些基质相关蛋白的相互作用，参与了肿瘤微环境的重塑和进展。
• C：展示了多个独立队列中的生存分析结果，分别包括Miyako210、PMID3247114、GSE135222和PMID3179460等数据集。每个生存曲线图都比较了FAP和COMP双高组和双低组的生存差异。结果显示，FAP和COMP高表达患者的生存期显著短于低表达患者，进一步证实了FAP和COMP在多个独立队列中作为不良预后标志物的潜在作用。

Summary：

• Figure 8通过多数据集和多个独立队列的分析，揭示了FAP和COMP在乳腺癌患者中的高表达与较差的预后相关。这些结果表明，FAP和COMP可能通过其在基质相关蛋白中的作用，影响肿瘤微环境，并通过调控免疫逃逸和基质重塑，促进肿瘤进展。它们在临床上可以作为潜在的治疗靶标，特别是针对肿瘤微环境的基质疗法。

临床意义：

• 通过多组学分析、单细胞测序和生物信息学工具，系统地研究了三阴性乳腺癌（TNBC）患者在接受PD-L1免疫治疗后的分子机制。
• 改善TNBC患者的治疗效果：TNBC是一种侵袭性强、预后较差的乳腺癌亚型，患者对传统化疗的响应率较低，缺乏有效的靶向治疗方法。免疫检查点抑制剂（如PD-L1抗体）的出现为TNBC的治疗带来了新的希望。然而，并非所有患者都对免疫治疗产生良好反应。本研究通过鉴定与免疫治疗反应相关的生物标志物（如FAP、COMP、LBP、LRG1），为个性化治疗提供了潜在的靶点，帮助识别哪些患者可能从PD-L1治疗中获益，从而提高临床疗效。
• 预后标志物的临床应用：研究表明，FAP和COMP的高表达与患者的预后不良相关。在多个独立队列中，FAP和COMP高表达的患者生存期显著短于低表达患者。因此，FAP和COMP可以作为TNBC患者的预后标志物，用于临床上预测患者的治疗反应和生存预后，帮助医生制定更有效的治疗策略。
• 靶向肿瘤微环境的治疗潜力：本研究发现FAP、COMP等基质相关蛋白在肿瘤微环境中的关键作用，尤其是在免疫逃逸和基质重塑中的调控。这为靶向肿瘤微环境提供了新的治疗思路，通过抑制这些基质蛋白，可能增强免疫治疗的效果，从而改善患者的生存预后。

创新性：

• 多层次组学数据整合：本研究结合了多种组学技术，包括单细胞RNA测序、蛋白质组学和生物信息学分析，不仅探讨了TNBC患者的整体基因表达模式，还深入分析了不同细胞类型（如成纤维细胞、免疫细胞）在肿瘤微环境中的作用。这种多组学数据的整合分析是研究设计的一个显著创新点，能够更全面地揭示免疫治疗中的复杂机制。
• 系统分析肿瘤微环境中不同细胞群体的作用：研究通过单细胞RNA测序，详细描绘了TNBC肿瘤微环境中不同免疫细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞的特征。特别是研究发现了不同癌症相关成纤维细胞（CAF）亚群的功能差异以及它们在肿瘤免疫调控中的作用。这种对肿瘤微环境的精细解读为未来靶向微环境治疗提供了新的见解。
• 探索补体系统与免疫治疗反应的关联：本研究揭示了补体系统在TNBC免疫治疗反应中的关键作用，尤其是补体级联激活与治疗反应的显著关联。这种对补体系统的深入研究为今后开发新的联合治疗方案提供了理论基础，补体抑制剂可能成为增强PD-L1疗效的潜在辅助手段。
• 跨数据集和跨队列验证：研究不仅在TCGA和Metabric等大型数据集中进行了验证，还结合了多个独立的临床队列（如Miyako210、GSE135222等）进行分析，确保了研究结果的可靠性和广泛适用性。这种多队列、多平台的数据验证为临床转化应用提供了坚实的依据。

好了，今天的文献分析就到这里了，这是一篇纯生信挖掘的思路非常好的文献了，作为临床医生，没有数据的话，可以结合这个文献思路进行充分的再研究设计。临床出身的我来说，我理解文章需求的迫切性。所以，各位朋友们要加油哈。另，目前我在澳门当牛马，有需要合作的可以找我哈。嘻嘻。