研究概述：
脊髓损伤Spinal cord injury (SCI)
本研究通过对公共数据集的分析筛选出有利于轴突再生的干细胞亚群，并通过流式细胞术分选出该CD271+ CD56+ BMSCs (CD271+ CD56+ bone marrow mesenchymal stem cells)，随后分离该群细胞外泌体获得CD271+CD56+ BMSC-Exos。结合体内外实验、microRNA测序，发现CD271+CD56+ BMSC-Exos可以将miR-431-3p转移到神经元中，从而抑制RGMA的表达，促进脊髓损伤后的轴突再生。
研究结果：
一、通过单细胞RNA数据寻找促进轴突再生的BMSC亚群
将数据库中人骨髓中分离的CD271+骨髓单个核细胞分为18个亚群(Figure 1A)。其中1、3、11和17群的BMSC标记基因水平高表达，包括NT5E（CD73）和NGFR（CD271）。将BMSC提取分为6群(Figure 1C)，在随后的GO，KEGG分析中发现，BMSC的5群显示了与神经再生相关的几个通路的富集，包括“中枢神经系统投射神经元轴突发生”、“轴突引导”和“轴突发育”等（Figure1D）。该群高表达NCAM(CD56)，为群5的标记基因。另外，与其他群相比，20个调节神经再生的基因在群5高表达。
二、CD271+CD56+ BMSC-Exos的获取和鉴定
通过流式分选活的CD271+CD56+骨髓间充质干细胞(Figure 2A)，并对第三代的CD271+CD56+BMSC表面marker进行鉴定(Figure 2B)。CD271+CD56+ BMSC-Exos与BMSC-Exos形态相似，符合外泌体的特征(Figure 2C-E)。外泌体干预示踪，在24小时观察到DRG中的红色荧光(外泌体)。
三、CD271+CD56+ BMSC-Exos水凝胶的特性
本研究使用GelMA光敏水凝胶负载CD271+CD56+ BMSC-Exos。该水凝胶孔隙形态良好，孔壁厚度均匀，表面光滑，连通性良好(Figure 3B)。在28天水凝胶降解了60%以上(Figure 3C)，且外敏体在其中分布均匀(Figure 3D)。负载的外泌体从水凝胶中持续释放，28天后达到累积量的80%。将pkh26标记的外泌体水凝胶植入小鼠SCI部位，脊髓损伤14天后在神经元中检测到红色荧光信号（Figure 3F）。活体失踪显示了水凝胶外泌体优于单独使用外泌体的缓释效果(Figure G, H)。
四、体内外实验证明CD271+CD56+ BMSC-Exos可改善脊髓损伤后的功能恢复，并增强轴突再生
通过小鼠SCI模型BMS评分，电生理分析，证实CD271+CD56+ BMSC-Exos水凝胶对SCI的治疗效果。免疫荧光结果显示，BMSC-Exos水凝胶和CD271+CD56+ BMSCExos水凝胶有效增加了脊髓损伤56天后损伤部位的NF+区域，CD271+CD56+ BMSC-Exos水凝胶的作用更强（图4D-F）。NF和突触素荧光双染，以评估再生轴突的突触形成能力，发现与 BMSC-Exos水凝胶相比，CD271+CD56+ BMSC-Exos水凝胶组表现出更高的突触素表达（图4G）。DRG体外培养，NF免疫荧光染色分析，发现与BMSC-Exos组相比，CD271+CD56+ BMSC-Exos组表现出更长的DRG轴突最大延伸距离和更多的轴突分支。
五、miR-431-3p介导CD271+CD56+ BMSC-Exos改善脊髓损伤后功能恢复和轴突再生的作用
为了确定介导轴突再生的潜在分子，对CD271+CD56+ BMSC-Exos进行了microRNA测序。共鉴定出61个差异表达的microrna（Figure 5A）。14个高表达的microRNA中，miR-431-3p与轴突再生密切相关，表现出最显著的差异表达。因此，选择miR-431-3p作为后续实验的靶分子。为确定CD271+CD56+ BMSC-Exos水凝胶是否能将miR-431-3p转移到神经元上，通过FISH技术证实，miR-431-3p主要在神经元中表达，与BMSC-Exos水凝胶组相比，CD271+CD56+ BMSC-Exos水凝胶组中其在神经元中的表达显著增加（Figure 5B-C）。为了进一步阐明miR-431-3p对介导CD271+CD56+ BMSC-Exos促进脊髓损伤后功能恢复的能力的影响，使用miR-431-3p抑制剂获得miR-431-3p敲低的CD271+CD56+BMSC。我们从CD271+CD56+BMSC和miR-431-3p敲除的CD271+CD56+BMSC中分离出外泌体，并通过Figure 4 部分相同体内外实验证实，miR-431-3p在CD271+CD56+ BMSC-Exos促进轴突再生过程中的重要作用。
六、RGMA过表达抵抗CD271+CD56+ BMSC-Exos对体外轴突再生的积极作用
为探究CD271+CD56+ BMSC-Exos通过miR-431-3p发挥作用的潜在机制，根据在线数据库和GO term（GO-0048681，轴突再生的负调控），RGMA被确定为抑制轴突再生的潜在靶基因（Figure 6A）。通过结合荧光素酶报告基因测试、体内外样本WB、DRG体外培养模型验证。
一些思考
在组织再生相关的研究，尤其基于干细胞相关结合生物材料应用的组织再生研究中，对干预后样本的转录组分析越来越多，但单细胞数据库的使用较少。创面愈合，肌肉缺损，神经损伤等等组织再生研究中，公共数据库单细胞数据分析筛选特殊亚群、差异基因、干预靶点作为寻找选题，文章开头；实验中细胞或组织样本转录组测序寻找相关通路；最后实验验证；如此 能够增加组织再生(尤其生物材料研究)研究分子机制部分的研究深度，同时逻辑更清晰，内容更完善。
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