文章概述
文章标题：《Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney》
发表日期和杂志：2021年发表在nature communications上
在线阅读链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-22368-w
研究目的：
通过整合单细胞转录组和染色质可及性数据（snRNA-seq和snATAC-seq），深入理解细胞异质性，并生成成人肾脏的细胞类型特异性的染色质可及性和转录组轮廓。
单细胞数据详情
研究方法：对五个健康成人肾脏样本进行snATAC-seq和snRNA-seq测序,样本来自年龄在50至62岁之间的患者，包括3名男性和2名女性。
数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE151302
单细胞数据详情：
提供了不同患者snATACseq以及snRNAseq数据，选择我们需要的snRNAseq下载即可
GSM4572187 Healthy1_snATACseq
GSM4572188 Healthy2_snATACseq
GSM4572189 Healthy3_snATACseq
GSM4572190 Healthy4_snATACseq
GSM4572191 Healthy5_snATACseq
GSM4572192 Healthy1_snRNAseq
GSM4572193 Healthy2_snRNAseq
GSM4572194 Healthy3_snRNAseq
GSM4572195 Healthy4_snRNAseq
GSM4572196 Healthy5_snRNAseq
GSM4572192_Control1_filtered_feature_bc_matrix.h5 24.3 Mb
GSM4572193_Control2_filtered_feature_bc_matrix.h5 8.9 Mb
GSM4572194_Control3_filtered_feature_bc_matrix.h5 17.5 Mb
GSM4572195_Control4_filtered_feature_bc_matrix.h5 11.9 Mb
GSM4572196_Control5_filtered_feature_bc_matrix.h5 9.9 Mb
给的是h5格式的文件，选择需要的数据下载之后使用Read10X_h5()函数读取，创建seurat对象进行后续的降维聚类分群即可
主要分析结果
单细胞降维聚类分群
数据处理：不同时间点处理的样本使用R包“Harmony”进行批次校正，以消除技术批次效应。
使用Seurat工具确定snRNA-seq样本的细胞组成，基于它们的转录轮廓对细胞进行注释，并指导snATAC-seq分析。
通过snRNA-seq基于谱系特异性标记物的表达鉴定了肾脏皮层内的所有主要细胞类型：
包括近曲小管(PT)、壁层上皮细胞(PEC)、升支厚壁(TAL)、远曲小管(DCT1, DCT2)、连接小管(CNT)、集合管(PC, ICA, ICB)、内皮细胞(ENDO)、肾小球细胞类型(MES, PODO)、成纤维细胞(FIB)和少量白细胞(LEUK)。
发现了一个表达VCAM1增加的近曲小管亚群(PT_VCAM1)，这个亚群还表达了HAVCR1（肾脏损伤分子-1），这是一个在急性损伤后近曲小管上调的基因，并且是长期肾脏预后的预测因子。
单细胞ATAC测序数据分析
snATAC-seq能够捕捉单个细胞的染色质可及性轮廓
数据整合方法：
使用Seurat软件和标签转移方法，基于注释过的snRNA-seq数据集来预测snATAC-seq数据集中的细胞类型，通过创建一个基因活性矩阵来衡量蛋白编码基因的基因体和启动子内的染色质可及性。
通过标签转移获得的snATAC-seq细胞类型预测与无监督聚类的结果相比较，表明两种数据集中都存在所有主要的细胞类型，且snATAC-seq在检测和分配细胞身份方面与snRNA-seq具有可比性。
snATAC-seq能够检测到近曲小管簇内的两个亚群，可能代表近曲小管（PCT）和近直小管（PST）。 PCT在SLC5A2（编码钠葡萄糖共转运蛋白2，SGLT2）的染色质可及性更高，而PST在SLC5A1（编码钠葡萄糖共转运蛋白1，SGLT1）的染色质可及性更高。
染色质可及性区域的检测
在snATAC-seq库中，共检测到214,890个可及染色质区域，涉及27,034个细胞。
将这些区域与之前发表的肾脏DNase I敏感位点（DHS）数据集进行比较，发现大约50%的区域与肾小球或肾小管间质中的DHS重叠。当数据集过滤为至少10%的细胞核中存在的区域时，重叠区域的比例增加到约85%。
使用Signac R包研究不同细胞类型之间的染色质可及性差异，基于DAR是“开放”还是“关闭”来区分细胞类型。
使用对数变化阈值0.25和Bonferroni调整后的p值来评估DAR的显著性（padj < 0.05）。大约20%的DAR与其相应细胞类型中的差异表达基因密切相关。
大多数DAR位于最近转录起始位点3kb内的启动子区域，第二常见的位置是内含子区域，DAR的分布在整个细胞类型中相对保守。
转录因子活性与染色质可及性：
转录因子是决定细胞命运和推动肾脏衰老及发育过程中细胞分化的关键因素。基于DAR（差异可及染色质区域）中结合位点的存在，可以预测单个细胞类型的转录因子活性
使用ChromVAR23工具，推断了snATAC-seq数据集中与转录因子相关的染色质可及性。
HNF4A编码了一个关键的转录因子，它驱动近曲小管的分化。ChromVAR检测到在近曲小管的DAR中HNF4A结合位点的富集，这一发现得到了HNF4A在snRNA-seq数据集中转录增加的支持
TAL细胞异质性的多模态分析
TAL细胞在皮质和髓质中调节钠氯平衡、尿液浓缩以及钙和镁的稳态
通过无监督聚类分析snRNA-seq数据集，在TAL中识别出三个细胞亚群。
一个亚群（SLC12A1+UMOD+）表达厚升肢标记物（CLDN16, KCNJ10, 和 PTH1R），被命名为TAL1； 另一个亚群表达另一组TAL特异性标记物，如CLDN10，被命名为TAL2
使用免疫组化技术验证了PTH1R和KCNJ10在UMOD+ SLC12A1+细胞亚群中的表达
在snATAC-seq数据集中分析了TAL亚群，并识别出三个细胞群组，这与snRNA-seq数据集中的发现相呼应
使用Seurat FindMarkers功能和chromVAR来鉴定相对于其余TAL细胞，两个TAL子集中HNF1B或ESRRB的转录因子基序活性增加（Bonferroni padj < 0.05）
并且识别区分TAL细胞群体的DAR，并使用Seurat FindMotifs功能对这些DAR进行转录因子基序富集
文章小结
研究发现snATAC-seq在细胞身份分配上与snRNA-seq具有可比性，并且能够进一步细化对肾小管功能异质性的理解。 大部分差异可及染色质区域位于启动子区域，并且与差异表达基因密切相关。 特定细胞类型的转录因子结合位点的富集揭示了NF-κB的激活，这促进了VCAM1的表达，并推动了近曲小管上皮细胞亚群之间的转变。 研究重新定义了近曲小管和升支厚壁的细胞异质性，并改善了在肾脏内检测独特细胞状态的能力。
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