豆豉是我国一种传统发酵豆制品，其中曲霉型豆豉是目前起源最早且分布最广的豆豉之一，占据广泛的消费市场。浏阳豆豉作为湖南省曲霉型豆豉的典型代表，采用传统古法工艺，用煮熟的黑豆进行两阶段发酵（制曲和渥堆发酵）。原料豆在微生物所产蛋白酶和自身生长代谢的作用下，将蛋白质、碳水化合物等大分子物质水解成小分子多肽和氨基酸，产生大量的风味物质。而微生物多样性的差异是造成豆豉风味差异的重要原因。然而，现阶段浏阳豆豉的工业化生产工艺尚未完善，多采用自然发酵（NF）的方式进行生产，群落结构易受到环境、气候等多方面的影响，导致其产品品质稳定性较差。近年来，多方研究表明，引入特定的微生物强化发酵进行控制和干预，可以在实现模拟NF过程中多菌株共同发酵的同时有效抑制杂菌污染，从而提升产品的稳定性。
湖南农业大学食品科学技术学院的周晓、李跑、刘洋*等以陕西肾型小黑豆为原料，利用实验室前期从浏阳豆豉中鉴定并分离纯化出4 株不产毒的优势黄曲霉菌株，采用NF、优势黄曲霉菌株（Aspergillus flavus 7214、A.flavus 7622、A.flavus 6112、A.flavus 5322）强化发酵以及混菌强化发酵（M4，A.flavus 7214∶A.flavus 7622∶A.flavus 6112∶A.flavus 5322＝1∶1∶1∶1）制备浏阳豆豉。通过对比不同优势菌株的产蛋白酶能力及酶系组成特点，结合强化发酵豆豉与NF豆豉的氨基酸态氮质量分数、水溶性蛋白质量分数、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、感官评价以及肽组成情况，分析强化发酵过程中蛋白质降解规律，进一步评价强化发酵菌株对浏阳豆豉鲜味的影响机制，以期为浏阳豆豉的品质提升和工业化生产菌株的选育和开发提供一定的理论支持。
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大豆含有约42%的蛋白质，微生物产生的蛋白酶能催化蛋白质水解生成多肽及小分子氨基酸，其活性也反映了豆豉中蛋白质水解的速率，决定了豆豉发酵成熟的周期。有研究表明，曲霉是发酵食品中重要的蛋白酶来源之一，可促使发酵食品中的蛋白质发生降解。如图2A所示，本实验所有菌株均表现出较强的产蛋白酶活性，其中A.flavus 5322菌株活力最强，总蛋白酶活力为（4314.43±26.73）U/g，其次为M4（混菌），A.flavus 7622最低，为（2516.62±67.39）U/g，且主要以碱性蛋白酶为主，但由于传统曲霉型豆豉发酵过程为酸性环境，碱性蛋白酶活力受到抑制，无法最大程度发挥效果。而从产酸性蛋白酶的分析结果发现，A.flavus 5322能力显著高于其余3 种菌及混菌。在曲霉属中鉴定的大多数蛋白酶可分为以下几种：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、氨肽酶和金属蛋白酶，各组主要的抑制剂分别为PMSF、E-64、pepstatin A、bestatin和EDTA。图2B结果表明，各菌株的蛋白酶主要受PMSF抑制剂的影响，且在A.flavus 5322中表现最为强烈，抑制率高达33.79%。E-64、pepstatin A和bestatin的抑制率在所有样品中普遍较低。EDTA的整体抑制效果较PMSF弱，但在不同菌株中检测到的抑制活性差异较大，在M4（混菌）中表现出最高的抑制活性。表明4 株黄曲霉菌株中主要以丝氨酸蛋白酶为主，半胱氨酸蛋白酶占比最小。Budak等研究了7 种曲霉的蛋白酶活力，也发现主要蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，这与丝氨酸蛋白酶编码基因是曲霉中最大的蛋白酶组分相关。EDTA的抑制效果可能源于其他类别蛋白酶的表达，同时也需要金属离子存在。![]()
2 不同菌株强化发酵豆鼓可溶性蛋白质和氨基酸态氮变化规律分析
如图3A所示，强化发酵豆豉和NF豆豉可溶性蛋白质量分数变化趋势类似，制曲阶段呈缓慢增长，洗霉（S8）工序引起可溶性蛋白质流失，造成其质量分数下降。渥堆阶段出现猛增，且在渥堆24 h（S9）达到最大值。而在渥堆48 h（S10）出现下降，可能随着转桶时食盐的加入，渗透压快速升高，豆豉中的酶系和微生物生长代谢均受到抑制，蛋白质降解能力变弱，而微生物生长代谢所需的氮源消耗了之前累积的氨基酸及小肽，导致可溶性蛋白质下降。其中，Q7214豆豉在S6（制曲第6天）降低了0.09%，这可能是不溶性大分子蛋白质的分解速率低于其降解产物被微生物利用的速率，导致其质量分数减少。渥堆结束后，5 种强化发酵豆豉的可溶性蛋白质量分数均高于NF豆豉（1.12%），其中QM4最高，达到1.62%，其次是Q5322（1.38%），说明强化发酵能在一定程度上增强蛋白质的水解。![]()
从图3B可以看出，不同豆豉发酵过程中氨基酸态氮的质量分数变化趋势和可溶性蛋白质类似。在制曲阶段（S1～S7）增加缓慢，洗霉阶段的冲洗引起游离氨基酸和肽流失，因此，洗霉后（S8）样品游离氨基酸态氮出现大幅度下降。在渥堆（S8～S10）期间，前24 h蛋白质水解剧烈，导致其迅速上升，而随着食盐的添加，抑制了蛋白酶活性，且部分游离氨基酸参与了美拉德反应，使得氨基酸态氮质量分数增幅减弱，这和陈怡的研究结果类似。通常，传统的发酵豆豉产品含有超过0.2%的游离氨基酸态氮被认为符合质量标准。因此，本研究中5 种强化发酵豆豉氨基酸态氮质量分数（1.11%（Q5322）～0.81%（Q7214））均大于NF豆豉，说明4 株菌株均适宜于豆豉的生产，且能促进蛋白质的水解。
蛋白质水解作用贯穿了豆豉发酵的全过程，选取豆豉生产过程中不同阶段的样品进行电泳分析。从图4可知，豆豉发酵过程中出现了大豆分离蛋白7S和11S组分的特征亚基条带，即α、α’、β亚基及酸性亚基AS和碱性亚基BS，5 种强化发酵豆豉中蛋白质水解趋势大体一致。前发酵阶段（S1～S8）蛋白质水解程度较弱，随着后发酵进行，分子质量在35 kDa以上的条带逐渐模糊，大豆蛋白7S组分和11S酸性亚基AS基本观察不到，发酵结束后（S10）蛋白质水解的最终产物的分子质量主要集中在10～15 kDa之间，说明在后发酵阶段开始，前发酵阶段积累的蛋白酶开始发挥作用，大分子蛋白质被迅速降解，生成小分子蛋白、多肽和氨基酸，这与可溶性蛋白质及氨基酸态氮分析结果相符合（图3）。发酵结束后，碱性亚基BS并未消失，说明在大豆发酵过程中，由于两种亚基结构紧密性的差异，亲水性酸性亚基比疏水性碱性亚基更容易降解。同时，从图中可以看出分子质量在10 kDa区域的条带存在明显的阴影区，这可能是因为小分子蛋白质较多，且分子质量相近，导致其难以区分。![]()
6 种豆豉样品的感官评价结果如图5A所示。所有样品表现出较强的鲜味和咸味，酸味、苦味和涩味得分较低，但差异也较为明显。强化发酵豆豉中，Q5322鲜味得分最高（7.1），其次是Q6112（7），其余3 种强化发酵豆豉均低于NF（6.9）。豆豉的鲜味主要来源于蛋白质降解生成的鲜味氨基酸和鲜味肽，此结果说明菌株A.flavus 5322和A.flavus 6112强化发酵能促进鲜味肽的生成。此外，Q5322咸度的增加能提升舌头对鲜味的感知，使得Q5322鲜味得分较高。豆豉的酸味来源于发酵过程中碳水化合物的降解，QM4酸味得分最低，仅为3.3 分。而苦味可能源于大豆发酵过程蛋白质和肽水解不平衡，导致酶水解产物中产生了苦味，虽然苦味会造成豆豉味道欠佳，但适度的苦味可提升豆豉的鲜味。除QM4和Q7214豆豉外，其余3 种强化发酵豆豉苦味相较于NF都出现不同程度的增强，其中Q5322最明显，苦味评分增强了25%。曲霉型豆豉由于制曲过程中的分生孢子而具有一定的涩味，5 种强化发酵豆豉的涩味评分均高于NF。![]()
电子舌结果表明，6 种豆豉整体风味轮廓相似，酸味得分均低于标样味觉值（－0.17）（图5B）。除Q53222以外，其余豆豉的咸味得分均低于标准溶液味觉值（－0.01）。从苦味来看，Q7622、Q7214、Q6112和QM4相较于NF豆豉都出现一定的增加，其中Q7622提升最为明显，达16.49%。综合来看，Q5322豆豉滋味最浓郁，表现为最强的鲜味、咸味和涩味，与感官评价结果一致；而其苦味得分最低，与感官评价结果相反，可能因为与鲜味-苦味在味觉受体水平上存在拮抗作用，电子舌具有单独的味觉传感器，因此苦味评估不受其他风味的影响。在本研究中，通过UPLC-QTOF-MS/MS从所有样品中鉴定出131 条短肽（六肽及以下）。进一步通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）建立能够区分6 种豆豉的分类模型，以鉴定的肽强度作为X变量，将不同豆豉样品作为Y变量，R2X（1）为0.41，R2X（2）为0.36，共同解释量为0.77，表明该模型稳定可靠，具有较强的预测能力。图6中可聚为3 组，分别为Q5322和NF豆豉、Q7622和Q7214豆豉以及QM4和Q6112豆豉，各组不同豆豉样本之间距离较近，表明两种豆豉在肽组成上相似。生产工艺的相似性可能是导致各组豆豉之间肽组成比较相近的原因。除Q5322强化发酵豆豉外，其余4 种强化发酵豆豉与NF豆豉之间都能实现良好区分，说明其在肽组成和含量上存在较大差异。为了更直观呈现豆豉中多肽组成对豆豉风味的影响，从已鉴定的6 种豆豉共有多肽中筛选出58 条肽（峰面积百分比＞0.1%）与滋味得分情况进行相关性热图分析。如图7A所示，部分多肽与感官鲜味表现出显著相关性。其中WG和LD分别与感官鲜味呈最强的负相关和正相关，而与电子舌相关性分析可以看出，LM和AF表现为较强的负相关，GGL、NL和VN等8 条多肽呈明显正相关。IGS、EK和LS则与感官鲜味和电子舌鲜味中均表现为正相关。EK在Noguchi等的研究中已被证明具有鲜味。目前已鉴定的鲜味肽共有99 条，其中有83 条鲜味肽含有鲜味氨基酸。一般情况下，鲜味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸等对短肽的鲜味有重要贡献。本实验筛选出36 条含有已知鲜味肽或鲜味氨基酸的短肽及与鲜味呈显著正相关的7 条潜在鲜味肽。
从图7B可知，Q6112和Q5322的潜在鲜味肽总峰面积接近，且明显大于NF豆豉，Q 7214 最低。DL、SV、VS和LD在所有样品中占比最大，且在6 种样品中均大于10%（12.98%～15.75%）。韩富亮等的研究证明，DL具有较强的鲜味，其阈值为2.5 mmol/L。已报道的鲜味肽中，除DL外，VD的相对峰面积在NF中占比达6.17%，在强化发酵豆豉中最高达10.76%（Q7622），最低为6.34%（QM4），EA、VDT、SVE和VG在5 种强化发酵豆豉中的相对峰面积相对于NF豆豉均出现了较大的提升。Azis等通过对豆渣进行强化发酵，也发现米曲霉发酵能提高蛋白质含量、氨基氮含量和蛋白质消化率，促进发酵过程中小分子质量肽和氨基酸的释放。本研究以NF豆豉为对照，不同菌株强化发酵豆豉为实验组，采用理化分析、感官评定结合UPLC-ESIQ-TOF-MS/MS分析不同豆豉发酵过程中的蛋白质降解情况和呈鲜特性差异，并通过相关性分析确定6 种豆豉中与鲜味相关的潜在鲜味肽。蛋白酶活力结果表明，A.flavus 5322活力最强，其酸性蛋白酶活性远高于其余3 株菌及混菌，4 株黄曲霉菌株及混菌中的蛋白酶系均以丝氨酸蛋白酶为主。强化发酵豆豉的氨基酸态氮和水溶性蛋白质量分数在渥堆结束后均高于NF，说明强化发酵能在一定程度上促进蛋白质的降解，结合SDS-PAGE结果分析，6 种豆豉的蛋白质降解趋势一致，均在渥堆期迅速降解。感官评价和电子舌结果均表明A.flavus 5322强化发酵豆豉具有最强的鲜味。利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS从Q7214、Q7622、Q6112、Q5322、QM4和NF豆豉中共鉴定出131 条短肽，通过相关性分析共筛选出43 条鲜味多肽，其中Q6112和Q5322潜在鲜味肽的总峰面积最高，且明显大于NF，已报道的鲜味肽中，DL、VD、EA、VDT、SVE和VG在5 种强化发酵豆豉中的相对峰面积相较于NF豆豉均出现了较大的提升。综上，强化发酵可通过促进蛋白质降解和潜在鲜味肽的释放提升豆豉的鲜味，且A.flavus 5322的效果显著。本研究有助于进一步解析强化发酵对浏阳豆豉风味的影响，为浏阳豆豉的品质提升和工业化生产菌株的选育提供理论支持。本文《不同黄曲霉菌株强化发酵对浏阳豆豉鲜味形成的影响》来源于《食品科学》2024年45卷第4期116-124页，作者：周 晓，李 跑，吴梓仟，唐 辉，徐巨才，蒋立文，覃业优，刘 洋。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230605-038。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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