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Introduction

Results and Discussion

基于B. coagulans在人类消化系统中的的生命周期，本研究着重分析了B. coagulans芽孢及营养体中与其在宿主体内生命周期密切相关的生理生化特性。首先，B. coagulans一般是以芽孢形态进入宿主胃肠道，并在肠道中萌发和繁殖。因此，本研究首先检测了所选菌株的芽孢在模拟胃肠道的耐受性（图1A）。实验结果显示，所有B. coagulans的芽孢在模拟胃肠道中均表现出高存活率（67.13%～73.12%）。随后，本文检测了芽孢在胃肠道中的萌发能力（图1B），实验结果同样显示这些菌株都可以在胃肠道自然状态下萌发，且萌发率也较高（35.49%～43.79%）。因此，这些实验结果表明，本研究所选的菌株的芽孢均可以耐受胃酸、胆盐和pH变化等多种环境因素的胁迫，并能在肠道环境下萌发。

图1  凝结芽孢杆菌芽孢在模拟胃肠道环境下的生理生化特性

与传统芽孢杆菌相似，B. coagulans的芽孢会在宿主小肠的十二指肠部位发芽并在小肠中增殖。因此，萌发后营养体在肠道中必然面临胆盐胁迫。菌株对胆盐的耐受能力是其基础生理特性，与其在肠道中存活和增殖能力密切相关。因此，本研究检测了所选菌株营养体在胆盐环境的耐受能力（表1）。实验结果表明，对比菌株在控制组和在添加胆盐（0.3%）MRS培养基中的生长延迟时间，这些菌株可以被清晰的划分为胆盐耐受菌株（B. coagulans GBI-30,6086和B. coagulans CCFM1041）和胆盐敏感菌株（B. coagulans-21、B. coagulans-30、B. coagulans-60和B. coagulans-90）。

为了评价小鼠的低度炎症症状，首先应对小鼠结肠组织病理学特征进行表征分析。造模组小鼠结肠出现了低度炎性损伤，具体表现为小鼠结肠切片中少量的淋巴细胞呈灶性浸润，说明小鼠出现轻微的炎性细胞浸润症状（图3B）。这表明，本研究中，IBS模型是成功建立的。小鼠在摄入B. coagulans CCFM1041和B. coagulans GBI-30,6086后，小鼠的结肠切片中结肠组织各层结构清晰，黏膜层上皮完整，上皮细胞形态正常，固有层肠腺数量丰富、且排列紧密，杯状细胞数量丰富，肌层肌细胞排列规则、形态正常，未见明显的炎性改变。然而，摄入其他B. coagulans菌小鼠结肠切片依然表现出灶性浸润症状，这表明B. coagulans CCFM1041和B. coagulans GBI-30,6086具有缓解肠道炎症症状的菌株特异性（图3C和D）。

图3  小鼠结肠组织病理学分析

图4  小鼠结肠促炎细胞因子及抑炎细胞因子的表达

图5  小鼠结肠肥大细胞类胰蛋白酶、PAR-2及血清皮质酮水平

菌群分析结果如图6所示，与空白组相比，造模组小鼠表现出肠道菌群多样性的显著性降低（图6A和B，P＜0.05）。具体表现为在Observed_OTUs多样性指数及Shannon多样性指数上的下降。这表明，模型的建立对肠道菌群多样性的OTU数量及多样性都造成了损伤。然而，摄入B. coagulans后，小鼠肠道菌群多样性发生了不同程度的变化。这表明，B. coagulans具有调节肠道菌群多样性的功效。

LEfSe分析显示不同组的肠道微生物群组成存在显著差异（图6C）。通过WAS和鼠柠檬酸杆菌处理后，相比空白组，造模组小鼠的肠道微生物群中观察到一些属的相对丰度显著降低，包括Faecalibaculum、Coriobacteriia、Parasutterella、Gordonibacter（图6C）。此外，与空白组相比，造模组中的Acinobacteria相对丰度呈下降趋势（图6D）。相反，补充B. coagulans GBI-30,6086和B. coagulans CCFM1041有助于恢复IBS小鼠体内的Acinobacteria水平（图6E和F）。此外，口服B. coagulans CCFM1041可显著恢复菌群中许多属的相对丰度，如Baciilus和Faecalibaculum等（图6F）。目前，一些研究已表明宿主肠道菌群的失调是构成IBS患者肠道炎症和内脏疼痛症状加剧的重要因素。因此，尽管潜在的机制并不清楚，但B. coagulans对宿主肠道菌群的恢复作用可能也有助于缓解患者IBS的严重性。

图6  小鼠肠道菌群多样性和组成分析

本研究中通过比较基因组对挑选菌株进行比较基因组分析，通过同源进行分析在B. coagulans中鉴定出2235个核心基因。基于这些核心基因，构建了系统发育树，以确认菌株的遗传距离。值得注意的是，B. coagulans GBI-30,6086和B. coagulans CCFM1041在系统发育树中被明确分类为相同的亚型（图7B）。对功能基因聚类分析也显示相同的聚类趋势（图7C）。考虑到本研究中B. coagulans基因组上的差异及其对IBS宿主肠道功能的调节作用，因此本研究将研究的菌株划分为2类，分别为有效组（B. coagulans GBI-30,6086和B. coagulans CCFM1041）和无效组（B. coagulans-21、B. coagulans-30、B. coagulans-60和B. coagulans-90）。此外，如图7D所示，在13个差异COG中，组I的功能基因与组II的功能基因显著不同，包括与COG1285、COG2200、COG2199、COG0439、COG2508、COG1126、COG0765和COG3328相关的可变基因（组I中的上调基因）以及与其他COG相关的冗余基因（组II中的上调基因）。功能基因的比较表明，B. coagulans GBI-30,6086和B. coagulans CCFM1041含有大量与脂质转运和代谢以及次级代谢产物生物合成、转运和分解代谢相关的基因（图7C）。

图7  凝结芽孢杆菌的比较基因组分析

Pearson相关性结果如图8示，值得注意的是，B. coagulans营养体的耐胆盐能力基本与所有肠道功能指标显著相关（P＜0.05）。例如，小鼠IBS症状的严重程度（内脏超敏感性和结肠炎性症状）与B. coagulans营养体的耐胆盐能力呈显著负相关（R＜-0.08），这说明耐胆盐能力强的B. coagulans更能缓解宿主IBS的临床症状。在其他肠道功能指标中，以结肠中的细胞因子水平为例，实验结果表明，包括IL-1β、IL-6和TNF-α均与B. coagulans营养体的耐胆盐能力呈显著负相关（R＜-0.08）。因此，这些结果强烈表明，B. coagulans营养体的耐胆盐能力与其在IBS模型下对宿主肠道功能的调节功能密切相关。此外，功能基因与IBS相关指数之间的相关性分析表明，小鼠皮质酮检测水平与菌株部分功能基因（脂质转运和代谢以及次级代谢产物生物合成、转运和分解代谢相关的基因）之间存在负相关。

图8  凝结芽孢杆菌调节肠道功能与其生理生化特征及功能基因相关性分析

Conclusion

综上所述，总之，本研究旨在筛选具有IBS缓解作用的凝结芽孢杆菌，并探究这些菌株的共同特征。根据实验结果，这些菌株的共同特征为：1）营养细胞对胆盐具有较强的的抗逆性，2）具备合成特定脂质和次级代谢产物的能力。因此，基于这两个指标筛选菌株可以降低筛选成本，并为挖掘新的功能性凝结芽孢杆菌株提供理论基础。

Alleviative effects of Bacillus coagulans strains on irritable bowel syndrome-unraveling strain specificity through physiological and genomic analysis

Jiang Cao^a,b, Leilei Yu^a,b, Jianxin Zhao^a,b, Hao Zhang^a,b,c,d, Wei Chen^a,b,c, Yuzheng Xue^e,*, Qixiao Zhai^a,b,*

^a State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

^b School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

^c National Engineering Research Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

^d Wuxi Translational Medicine Research Center and Jiangsu Translational Medicine Research Institute Wuxi Branch, Wuxi 214122, China

^e Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214122, China

*Corresponding author.

Abstract

The high intraspecies heterogeneity of Baciillus coagulans leads to significant phenotypic differences among different strains. Thus, 6 B. coagulans strains were tested in the present study using an irritable bowel syndrome (IBS) animal model to determine whether the IBS-alleviating effects of B. coagulans strains are strain-specific. The results of this study showed that the ingestion of B. coagulans GBI-30, 6086, and B. coagulans CCFM1041 significantly alleviated IBS symptoms in mice. In contrast, other B. coagulans strains showed no or limited alleviating effects on IBS symptoms. According to our experimental results, the two main common features of these strains were as follows: 1) The resistance of vegetative cells to bile salts, and 2) ability to synthesize specific lipids and secondary metabolites. Screening strains based on these two indicators may greatly reduce costs and provide a basis for mining new functional B. coagulans strains. Our results also suggest that administration of B. coagulans could significantly regulate microbiota dysbiosis in animal models. Moreover, the close relationships between the gut microbiota, gut microbiota metabolites, and IBS were further confirmed in this study.  

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