论著 · 烧创伤相关肺损伤｜铁死亡在大鼠烧冲复合伤合并急性肺损伤中的作用及其机制
文摘
科学
2024-11-11 17:00
北京
铁死亡在大鼠烧冲复合伤合并急性肺损伤中的作用及其机制
作者单位：新乡医学院第三附属医院，河南省创伤与骨科医学重点实验室，新乡 453003；空军军医大学第一附属医院全军烧伤中心，烧伤与皮肤外科，西安 710032
引用本文：张浩, 官浩, 汪宇航, 等. 铁死亡在大鼠烧冲复合伤合并急性肺损伤中的作用及其机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(11): 1-9. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240528-00199.
摘要
目的 探讨铁死亡在大鼠烧冲复合伤合并急性肺损伤中的作用及其机制。
方法 该研究为实验研究。取24只8周龄雄性SD大鼠，按照随机数字表法分为对照组和实验组，每组12只，实验组大鼠麻醉后进行爆炸处理以制作烧冲复合伤合并急性肺损伤模型，对照组大鼠行模拟致假伤处理。伤后24 h，采用苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观测肺组织的病理形态，采用酶联免疫吸附测定法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）的上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）及IL-6的水平，采用全自动动物血气分析仪检测腹主动脉血的动脉血氧分压（PaO2）和动脉血二氧化碳分压（PaCO2），称重肺组织并计算其干湿比重，采用二喹啉甲酸法测定BALF中的总蛋白浓度，基于苏木精-伊红染色对肺损伤情况进行评分，采用相关试剂盒检测大鼠肺组织匀浆液中氧化应激因子活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽、亚铁离子水平，采用免疫荧光法和免疫组织化学法检测肺组织中铁死亡相关分子谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、脂质过氧化相关分子4-羟基壬烯醛（4-HNE）及DNA氧化损伤相关分子8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的表达量，采用透射电子显微镜观察肺组织细胞中线粒体形态。样本数均为6。
结果 伤后24 h，对照组大鼠肺组织结构清晰完整，肺泡壁正常；实验组大鼠的肺组织水肿明显，肺泡壁变厚、结构不清晰。伤后24 h，与对照组相比，实验组大鼠BALF的上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均显著升高（t值分别为3.96、9.84、10.60，P<0.05）；实验组大鼠肺组织干湿比重、肺损伤评分以及BALF中总蛋白浓度均明显升高（t值分别为6.91、6.64、10.04，P<0.05），腹主动脉血的PaO2明显下降（t=8.85，P<0.05）而PaCO2未见明显变化（P>0.05）；实验组大鼠的肺组织匀浆液中SOD及谷胱甘肽水平均明显降低（t值分别为4.36和8.56，P<0.05），活性氧、丙二醛和亚铁离子水平均明显升高（t值分别为11.55、9.78、14.77，P<0.05）。伤后24 h，免疫荧光染色和免疫组织化学染色显示，实验组大鼠肺组织中GPX4的表达量分别为0.245±0.024、0.786±0.240，明显低于对照组的1.000±0.305、1.000±0.200（t值分别为6.05和2.60，P<0.05）；实验组大鼠大鼠肺组织中4-HNE的表达量分别为5.93±1.05、2.21±0.23，均明显高于对照组的1.00±0.29、1.00±0.23（t值分别为11.13和9.16，P<0.05）；实验组大鼠大鼠肺组织中8-OHdG的表达量分别为2.08±0.40、1.61±0.29，均明显高于对照组的1.00±0.40、1.00±0.26（t值分别为4.72和3.87，P<0.05）。伤后24 h，与对照组相比，实验组大鼠肺组织细胞中线粒体的双层膜密度增加、外膜破裂、嵴减少。
结论 在烧冲复合伤合并急性肺损伤大鼠中，肺组织细胞存在DNA氧化损伤，肺组织中抗氧化体系失衡、抗铁死亡的关键分子GPX4表达下降，提示铁死亡参与了其病理生理过程。
关键词：烧伤，吸入性；急性肺损伤；氧化应激；烧冲复合伤；铁死亡
烧冲复合伤是指患者在同一时间或者相继时间内受到热能烧伤和冲击波产生的冲击伤的复合型损伤［1］。该类损伤的特点是不仅存在热力烧伤也存在冲击波带来的内脏损伤，致使患者在救治过程中容易出现休克、窒息、感染以及多脏器衰竭，致死率高，病理机制复杂［2-3］。该类患者肺不仅存在烧伤并发症中的吸入性损伤，也存在冲击波带来的冲击伤，因此肺是发生烧冲复合伤时诸多脏器中伤情最为严重的，肺损伤也是早期临床救治中的难点和关键［4］。目前关于急性肺损伤的机制研究主要集中在坏死、凋亡、自噬以及铁死亡等程序性细胞死亡方式［5-8］。值得注意的是，铁死亡是一种铁依赖性的、非凋亡性的细胞死亡形式，细胞内铁代谢异常可导致活性氧增加、DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）表达增加，特别是脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）的积累以及抗铁死亡关键分子谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）表达降低［9］。铁死亡在多种疾病，如脑出血、肿瘤疾病，特别是急性肺损伤中发挥重要作用［10-11］。相关报道显示，铁死亡在淹溺性肺损伤、脓毒症相关肺损伤、放射性肺损伤中都发挥重要作用，但是铁死亡在烧冲复合伤合并急性肺损伤中是否发挥作用鲜见报道［12-14］。因此，本研究通过激波管气体爆炸生物杀伤实验系统建立大鼠烧冲复合伤合并急性肺损伤模型，观察肺损伤的程度，研究铁死亡在肺损伤中的作用及其机制。本实验研究遵循空军军医大学动物实验伦理委员会和国家有关实验动物管理和使用的规定。24只8周龄、体重为200~220 g的健康无特殊病原体级雄性SD大鼠，由空军军医大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK（军）2012-0022。戊巴比妥钠购自上海上药新亚有限公司，显微镜固定液购自武汉塞维尔生物有限公司，锇酸购自美国Ted Pella Inc公司，PBS、胎牛血清封闭液和TNF-α、IL-1β及IL-6的ELISA检测试剂盒及兔源性GPX4多克隆抗体、兔源性4-HNE多克隆抗体购自北京索莱宝科技有限公司，二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒购自北京碧云天生物科技有限公司，SOD、谷胱甘肽、丙二醛测定试剂盒及组织铁测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，活性氧ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，兔源性髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）多克隆抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司，小鼠源性8-OHdG多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体以及异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、驴抗小鼠IgG多克隆抗体购自美国Abcam公司。激波管气体爆炸生物杀伤实验系统由新乡医学院第三附属医院提供，i15型全自动动物血气分析仪购自深圳理邦公司，EVOS FL Auto 2型激光扫描共聚焦显微镜购自美国Invitrogen公司，Infinite M200 Pro型全波长多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司，倒置相差显微镜购自德国ZEISS公司，GK-G70S鼓风干燥箱购自常州恒隆公司，HT7700型透射电子显微镜购自日本日立公司。取24只大鼠，适应性饲养在标准环境下7 d，采用随机数字表法将大鼠分为对照组与实验组，每组12只。实验组大鼠采用激波管气体爆炸生物杀伤实验系统进行造模。具体方法如下，采用2.5 g/L戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后将大鼠固定于激波管气体爆炸生物杀伤实验系统专用支架上，该支架距离爆炸源10 cm。爆炸源内为30 L含体积分数10%甲烷气体的混合空气，检查气密性后点火引爆。爆炸1 min后取出大鼠，见大鼠皮毛烧焦、口鼻周围胡须烧断、口鼻及四肢肿胀；在麻醉苏醒后，大鼠精神萎靡，视为造模成功，见图1。对于对照组大鼠，除激波管气体爆炸生物杀伤实验系统未爆炸模拟致假伤外的其余处理均同实验组。伤后24 h，每组任意选取6只大鼠，同前麻醉后采集腹主动脉血、肺组织及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）备用。其中BALF的具体采集方法如下：麻醉大鼠后结扎右支气管，用1 mL预冷的PBS灌注左支气管，灌注液停留1 min后收集灌洗液，共灌注3次。![]()
取1.2中采集的大鼠右肺组织，常规固定后制作石蜡切片（厚度为4 μm）。常规行HE染色和免疫组织化学染色。HE染色后在光学显微镜20倍放大倍数下观察肺组织形态并拍照。免疫组织化学染色的一抗为兔源性MPO多克隆抗体（稀释比为1∶100）、二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶300），采用二氨基联苯胺显色后进行镜检，阳性染色为棕色。取1.2采集的大鼠左肺BALF，4 ℃、700×g离心10 min后取上清液。按照ELISA检测试剂盒说明书，采用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，并计算TNF-α、IL-6和IL-1β水平。样本数为6。取1.2采集的腹主动脉血，并立即用全自动动物血气分析仪检测PaO2和PaCO2。样本数为6。取1.2采集的大鼠左肺组织，使用PBS清洗并使用滤纸吸出多余水分后立即进行称重，记为W1。随后将肺组织置于80 ℃的烘箱中烘干24 h，再次称重，记为W2，计算干湿比重。肺组织的干湿比重=W2÷W1，样本数为6。取1.2中对照组和实验组剩余的6只大鼠，同前收集BALF，然后提取大鼠右肺组织并浸泡在预冷的PBS中备用。按照二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒的说明书，测定BALF中的总蛋白浓度。样本数为6。基于1.3中经HE染色的肺组织在显微镜下的观察结果，对肺损伤情况进行评分［15］，评分项目包括水肿、充血、炎症细胞浸润、支气管内出血和碎屑、细胞增殖，每项的评分按损伤程度分为0、1、2、3分，结果取5项评分总和。样本数为6。取1.5.3中的肺组织，使用眼科剪剪碎，然后在冰上超声裂解以制备组织匀浆液。4 ℃、280×g离心10 min后取上清液，按照相关说明书分别检测活性氧、丙二醛、SOD、谷胱甘肽、亚铁离子的水平。样本数为6。1.7 免疫荧光法和免疫组织化学法检测肺组织中铁死亡与脂质过氧化及DNA氧化损伤相关分子的表达
取1.3中石蜡切片，然后常规行免疫荧光染色。一抗为兔源性4-HNE多克隆抗体（稀释比为1∶200）、兔源性GPX4多克隆抗体（稀释比为1∶200）、小鼠源性8-OHdG多克隆抗体（稀释比为1∶300），二抗为异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体及驴抗小鼠IgG多克隆抗体（稀释比为1∶300）。用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚的防荧光淬灭染液孵育5 min后，在激光扫描共聚焦显微镜20倍放大倍数下观察荧光（阳性染色为绿色）强度。另取石蜡切片，常规行免疫组织化学染色。一抗的种类及其稀释比均同前，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体及驴抗小鼠IgG多克隆抗体（稀释比均为1∶300）。二氨基联苯胺显色后，在激光扫描共聚焦显微镜40倍放大倍数下观察阳性表达（棕色）情况。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）对免疫荧光染色、免疫组织化学染色结果进行量化处理。以对照组大鼠各指标的表达量为参照，计算实验组大鼠各指标的相对表达量，样本数为6。取1.2采集的肺组织，制备成1 mm3大小组织块并置于显微镜固定液中。注意在取材过程中避免牵拉或挤压等导致的机械损伤。将组织块在环境温度下常规固定2 h后转移到4 ℃冰箱中过夜。用锇酸固定2 h后，用梯度丙酮脱水，然后包埋在环氧树脂混合物中，制作切片（厚度为50~100 nm）。对切片进行乙酸铀酰和硝酸铅染色，室温自然风干2 h后，在透射电子显微镜20 000倍放大倍数下观察细胞中线粒体的形态。采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以![]()
表示，组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。伤后24 h，对照组大鼠肺组织结构清晰完整，肺泡壁正常，无渗出、出血，伴少量炎症细胞浸润；实验组大鼠的肺组织水肿明显，肺泡壁变厚、结构不清晰，伴出血和炎症细胞浸润，坏死细胞明显增加，见图2。![]()
伤后24 h，与对照组相比，实验组大鼠BALF的上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均显著升高（P<0.05）。见表1。![]()
伤后24 h，与对照组相比，实验组大鼠肺组织干湿比重、肺损伤评分及BALF中总蛋白浓度均明显升高（P<0.05），腹主动脉血中的PaO2明显下降（P<0.05）而PaCO2未见明显变化（P>0.05）。见表2。![]()
伤后24 h，与对照组相比，实验组大鼠的肺组织匀浆液中SOD及谷胱甘肽水平均明显降低（P<0.05），活性氧、丙二醛和亚铁离子水平均明显升高（P<0.05）。见表3。![]()
2.5 肺组织中铁死亡与脂质过氧化及DNA氧化损伤相关分子的表达
免疫荧光染色和免疫组织化学染色结果均显示，伤后24 h，与对照组相比，实验组大鼠肺组织中的GPX4表达量明显降低（P<0.05），4-HNE及8-OHdG表达量明显增加（P<0.05）。见图3、表4。![]()
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伤后24 h，与对照组相比，实验组大鼠肺组织细胞中线粒体的双层膜密度增加、外膜破裂、嵴减少，并且线粒体中出现不同的空泡样改变。见图4。![]()
烧冲复合伤的主要损伤靶器官为颅脑、腹腔脏器和肺［16］。肺承担着机体的换气作用，由于其是空腔脏器，受力面积大，当发生烧冲复合伤时，易导致急性肺损伤［17］。临床中，发生急性肺损伤是烧冲复合伤患者早期死亡的主要原因［18］。目前针对烧冲复合伤合并急性肺损伤的研究进展迅速，相关研究证明冲击波通过应力波和剪切波来损伤肺组织，使得肺泡内空气聚集产生内爆效应，导致肺泡破裂出血［19-20］。李百玲等［21］通过建立大鼠烧冲复合伤模型观察到，伤后肺泡不同程度出血、肺泡间隔水肿，伴有红细胞和炎症细胞浸润等。相关临床报道显示，早期的爆炸性肺损伤患者在伤后12 h内显著缺氧［22］。本团队成功采用激波管气体爆炸生物杀伤实验系统进行造模，经过前期多次实验条件探索，使得该造模系统稳定且重复性好。本研究显示，实验组大鼠肺组织中肺泡间隔水肿、肺泡出血，伴有炎症细胞浸润；进一步的检测显示大鼠肺组织中的炎症因子表达水平增加、肺水肿增加、肺损伤评分升高；血气分析显示PaO2明显下降，这与前述研究结果相似。目前关于烧冲复合伤合并急性肺损伤的机制研究引起学者的关注［23-24］。相关研究显示，烧冲复合伤合并急性肺损伤鼠的肺泡上皮细胞会释放大量的炎症因子如IL-1、IL-6、及TNF-α等，这些炎症因子会进一步引发炎症级联反应，导致组织损伤并加速肺组织纤维化和呼吸功能障碍［25-26］。本研究也显示，BALF中炎症因子水平在伤后会明显升高。相关研究显示，烧冲复合伤大鼠肺组织中的胱天蛋白酶3及B淋巴细胞瘤-2表达水平明显升高［21］，提示细胞凋亡可能参与肺损伤的病理生理过程。还有研究显示，在烧冲复合伤小鼠肺组织中的中性粒细胞外陷阱因子的表达水平明显升高［27］，这可能与伤后肺泡出血以及炎症因子过表达有关。铁死亡是由脂质过氧化氢解毒和铁依赖性活性氧积累之间的不平衡引发的。值得注意的是，铁死亡这种特殊的细胞程序性死亡方式与各种病因的急性肺损伤均密切相关［28］。当机体发生损伤时，调节铁代谢的几种蛋白如转铁蛋白、铁蛋白、铁调素和膜铁转运蛋白等会发生不同程度的功能障碍［29］，导致细胞中的铁稳态失衡，并且以亚铁离子的形式积聚在细胞内，而病理性的铁积累会介导细胞的氧化损伤和死亡，因此铁过载也是铁死亡一个重要标志［30-31］。而当铁过载后，DNA、蛋白质和膜脂质会发生不同程度损伤，若此时机体清除脂质过氧化产物的能力下降，则细胞会发生铁死亡［32］。在生理状态下，胱氨酸从胞外被转运至胞内，然后在一系列酶作用下生成谷胱甘肽，而谷胱甘肽在GPX4的作用下可清除活性氧，发挥抗氧化的作用［33］。GPX4的功能损害会导致脂质过氧化产物如丙二醛、4-HNE等的积累以及机体抗氧化能力的降低，进一步导致细胞内DNA氧化损伤，最终导致铁死亡的发生［34］。本研究的结果显示，烧冲复合伤合并急性肺损伤大鼠的肺组织中亚铁离子表达明显增加，抗氧化相关分子SOD、谷胱甘肽表达明显降低，脂质过氧化产物丙二醛和4-HNE等表达明显增加，活性氧表达明显增加，DNA氧化损伤标志物8-OHdG表达明显增加，但抗铁死亡关键调控分子GPX4表达则明显降低，提示铁死亡参与了烧冲复合伤合并急性肺损伤的病理变化，可能发挥关键作用。综上所述，本团队通过激波管气体爆炸生物杀伤实验系统成功建立了大鼠烧冲复合伤合并急性肺损伤模型，检测显示伤后肺组织水肿、渗出增加，肺泡出血以及炎症细胞浸润增多，与此同时，肺组织中亚铁离子积聚、脂质过氧化产物增加，抗氧化体系减弱，活性氧明显增加以及抗铁死亡关键分子GPX4表达下降，提示铁死亡在烧冲复合伤合并急性肺损伤中发挥作用。这为烧冲复合伤的防治提供了可能的靶点。然而，在烧冲复合伤的发生过程中，炎症损伤、活性氧的产生以及脂质过氧化等调控过程复杂多变，其具体的机制还需要进一步的研究。作者贡献声明
张浩：起草文章、实施研究；官浩：对文章内容作批评性审阅，经费支持；汪宇航：动物实验操作及标本收集；张万福、田林强：数据收集与分析；任文杰：经费支持、审阅文章参考文献略
引用本文: 朱邦晖, 赖宏豪, 魏晨如, 等. 过表达膜联蛋白A1的人脂肪间充质干细胞治疗急性呼吸窘迫综合征小鼠的效果及其机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2023, 39(5): 456-464. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220408-00130.
引用本文: 尹希, 周万芳, 侯文佳, 等. 沉默非肌肉肌球蛋白Ⅱ骨髓间充质干细胞移植对内毒素/脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺细胞外基质的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(5): 422-433. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220212-00024.
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