论著 · 烧创伤相关肺损伤｜人吸入性损伤与循环炎症蛋白之间因果关系的双样本孟德尔随机化分析
文摘
科学
2024-11-05 11:01
北京
人吸入性损伤与循环炎症蛋白之间因果关系的双样本孟德尔随机化分析
作者单位：海军军医大学第一附属医院烧伤外科，全军烧伤研究所，中国医学科学院烧伤暨烧创复合伤救治关键技术创新单元，上海 200433代站站现在海军军医大学卫勤训练基地，上海 200433
引用本文：代站站, 朱沁, 佟希睿, 等. 人吸入性损伤与循环炎症蛋白之间因果关系的双样本孟德尔随机化分析[J]. 中华烧伤与创面修复杂志. Doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20240429-00155.
摘要
目的 探究人吸入性损伤与循环炎症蛋白之间的因果关系。
方法 该研究为基于双样本孟德尔随机化（MR）分析的研究。以吸入性损伤为暴露因素，91种循环炎症蛋白为结局，从全基因组关联分析数据库中获得吸入性损伤（216 993个样本）和91种循环炎症蛋白（14 824个样本）的数据，采用双样本MR分析方法进行分析。根据连锁不平衡分析获得与吸入性损伤显著相关的独立位点单核苷酸多态性（SNP）作为工具变量，主要采用逆方差加权（IVW）法进行吸入性损伤与91种循环炎症蛋白之间因果关系的分析，进一步使用加权中位数法、加权模式法、MR-Egger法和简单模式法进行验证。根据前述IVW法分析结果，针对符合假设的吸入性损伤SNP，进行Cochran Q检验评估异质性，进行MR-Egger回归检验、MR-PRESSO离群值检验评估水平多效性，进行留一法分析评估可靠性。
结果 筛选出6个达到显著阈值（P<5×10-5）的SNP作为代表吸入性损伤的工具变量，其F值均>10，提示均为强相关工具变量。基于6个吸入性损伤SNP，IVW法分析显示，吸入性损伤与白细胞介素20（IL-20）、IL-20受体亚基α（IL-20RA）、IL-5、肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF9）之间均存在显著因果关系（比值比分别为1.01、1.01、1.02、1.01，95%置信区间分别为1.00~1.02、1.00~1.03、1.01~1.03、1.00~1.03，P<0.05）。使用加权中位数法和MR-Egger法验证，结果显示，吸入性损伤与IL-5（比值比分别为1.02、1.03，95%置信区间分别为1.00~1.04、1.01~1.04，P<0.05）、TNFRSF9（比值比分别为1.02、1.03，95%置信区间分别为1.00~1.04、1.01~1.04，P<0.05）之间均存在显著因果关系；使用加权模式法和简单模式法验证，结果显示，吸入性损伤与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9之间的因果关系不明显（P值均>0.05），仍需以IVW法结果为准。根据前述IVW法分析结果，Cochran Q检验评估显示，与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9存在显著因果关系的6个吸入性损伤SNP均不存在显著异质性（Q值分别为2.67、5.00、5.17、5.29，P>0.05）；MR-Egger回归检验、MR-PRESSO离群值检验评估显示，与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9存在显著因果关系的6个吸入性损伤SNP均不存在显著水平多效性（截距分别为0.01、<0.01、-0.02、-0.03，RSSobs值分别为3.33、9.00、7.88、7.26，P>0.05）；留一法分析显示，吸入性损伤与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9之间的显著因果关系在逐个剔除6个吸入性损伤SNP后结果稳定可靠。
结论 通过双样本MR分析，明确吸入性损伤与4种循环炎症蛋白IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9存在显著因果关系，提示发生吸入性损伤后以上4种循环炎症蛋白的生成呈增多趋势。
关键词：孟德尔随机化分析；数据库，遗传学；因果律；吸入性损伤；循环炎症蛋白
吸入性损伤是指吸入热气、烟雾、化学物质或其他有害气体后引起的呼吸道和肺组织的损伤，是烧伤常见的合并症［1］。随着烧伤重症救治水平的提高以及创面修复手段的不断进步，重症烧伤患者的病死率不断下降［2］，但是吸入性损伤的救治仍然缺少针对性的措施［3-5］，对其病理生理机制认识不够完全清晰是阻碍其临床治疗的重要原因之一［6］。有研究表明，氧化应激和炎症反应失调是吸入性损伤的重要病理生理机制，涉及多种炎症细胞以及炎症蛋白［7］，临床表现为液体复苏需求量增加、肺功能障碍进行性加重、呼吸机使用时间延长、肺炎风险增加和ARDS等并发症的发生［8-9］。循环炎症蛋白是一组在对损伤或感染的免疫反应中起着关键作用的分子集合，包括细胞因子、趋化因子、急性期反应物和其他介质［10］，参与包括烧伤、脓毒症、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和凝血障碍等在内的多种疾病的发生发展［11-12］。目前常用的观察性研究难以确切且全面地明确吸入性损伤患者体内循环炎症蛋白的变化趋势。孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析是一种利用遗传变异作为工具变量来剖析因果关系的分析技术，为解决上述问题提供了一种有效的手段，可以消除环境因素和生活方式等混杂因素的影响，而且基因变异不受疾病进程的影响，这降低了反向因果偏差的可能性，被认为是确定因果关系的有效方法［13］。MR分析已在新型冠状病毒感染、糖尿病等许多疾病研究中被广泛应用［14-16］，本研究拟利用已有的91种循环炎症蛋白的基因数据［17］，采用双样本MR分析方法，了解吸入性损伤与循环炎症蛋白的可能因果关系，以期为吸入性损伤的临床救治提供新方向。本研究中使用的所有数据集均来自全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）数据库，均属于可下载的去标识化的公共数据，不需要额外的伦理审批。以吸入性损伤为暴露因素，循环炎症蛋白为结局，根据下述标准从GWAS数据库中筛选单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为工具变量［13］，采用双样本MR分析方法进行分析。MR分析因果推理中有效的工具变量必须同时满足3个关键假设：（1）遗传变异与暴露因素具有强关联性；（2）遗传变异与暴露因素和结局之间可能存在的混杂因素无关，这些混杂因素包括且不限于年龄、烧伤总面积、性别、肺炎、急性肾损伤和吸烟；（3）遗传变异不会通过暴露因素以外的途径影响结局［18］。吸入性损伤与循环炎症蛋白的双样本MR分析核心假设与分析流程见图1。![]()
吸入性损伤的数据集包含216 993名欧洲人的GWAS数据（数据集编号：finn-b-J10_CHEMGASRESP），包括127个吸入性损伤病例和216 866个对照病例，共16 380 466个SNP。循环炎症蛋白的数据集包含91种炎症蛋白的GWAS数据（登记号从GCST90274758到GCST90274848），是由Zhao等［17］利用Olink Target平台对14 824名参与者测量的91种循环炎症蛋白进行全基因组蛋白质定量性状位点分析而获得的可使用的基因数据。参照以往文献［19-20］，设置显著阈值P<5×10-5作为筛选条件以满足关联性假设，筛选出合适SNP作为吸入性损伤的工具变量。选择聚合距离为10 000 kb，将连锁不平衡标准设定为R2<0.001，以获得独立位点的工具变量。采用公式“F=（beta/se）2”计算F值，beta代表SNP对吸入性损伤表型的效应量，se代表beta值的标准误。F≥10代表强相关工具变量，剔除F<10的弱工具变量。在ieu openGWAS网站逐个输入SNP的名称，直接查询其是否与年龄、烧伤总面积、性别、肺炎、急性肾损伤和吸烟等因素相关。1.4 吸入性损伤与炎症蛋白因果关系的双样本MR分析及相关验证
此次双样本MR分析主要应用逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）法。IVW法是MR分析中的经典方法，结合了多个遗传变异数据（SNP效应与SNP暴露效应之比的Wald估计值），并根据每个SNP效应关联的逆方差进行加权［21］，可有效避免混杂因素的影响。进一步使用加权中位数法、加权模式法、MR-Egger法和简单模式法进行验证，若结果与IVW法保持一致可加强结果的说服力，若结果与IVW法不一致则以IVW法结果为准。对前述IVW法分析结果中存在显著因果关系的数据，进行敏感性分析。针对符合假设的吸入性损伤SNP，进行以下评估：（1）Cochran Q检验，评估SNP的异质性，设定P<0.05表明SNP存在显著异质性［22］。（2）MR-Egger回归检验、MR-PRESSO离群值检验，评估SNP的水平多效性。MR-Egger回归检验的零假设是截距等于0，如果截距显著不同于0（P<0.05），则表明存在水平差异，即工具变量对结果有直接的影响，而不通过暴露变量；MR-PRESSO离群值检验中，RSSobs代表观察到的所有工具变量残差平方和的总和，若其对应的P值<0.05则表明该工具变量为显著离群值。（3）留一法分析，评估SNP的可靠性。通过逐次剔除工具变量，评估显著因果关系是否由单个SNP决定，beta值均在0点同侧说明结果可靠，误差线均在0点同侧则说明结果非常可靠［23］。采用R 4.2.1软件及其中的“TwoSampleMR”软件包（0.5.7版）进行数据分析，效应值采用比值比和95%置信区间表示，P<0.05表示差异有统计学意义。筛选出6个达到显著阈值（P<5×10-5）的SNP作为代表吸入性损伤的工具变量，其F值均>10，提示均为强相关工具变量。ieu openGWAS网站查询结果显示，这6个SNP与年龄、烧伤总面积、性别、肺炎、急性肾损伤和吸烟等混杂因素均不相关，最终确定的6个吸入性损伤SNP的详细信息见表1。![]()
通过IVW、加权中位数法、加权模式法、MR-Egger法和简单模式法分析显示，吸入性损伤与4种循环炎症蛋白IL-20、IL-20受体亚基α（interleukin-20 receptor subunit alpha，IL-20RA）、IL-5及TNF受体超家族成员9（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9）存在明确的因果关系，与其余87种循环炎症蛋白不存在明确的因果关系。见图2。![]()
进一步地，IVW法分析显示，吸入性损伤与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9均存在显著因果关系（P<0.05）。使用加权中位数法和MR-Egger法验证，结果显示，吸入性损伤与IL-5、TNFRSF9均存在显著因果关系（P<0.05）；使用加权模式法和简单模式法验证，结果显示，吸入性损伤与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9的因果关系不明显（P值均>0.05），仍需以IVW法结果为准。见表2。![]()
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根据前述IVW法分析结果，Cochran Q检验评估显示，与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9存在显著因果关系的6个吸入性损伤SNP均不存在显著异质性（P>0.05）；MR-Egger回归检验、MR-PRESSO离群值检验评估显示，与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9存在显著因果关系的6个吸入性损伤SNP均不存在显著水平多效性（P>0.05）；留一法分析显示，吸入性损伤与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9的显著因果关系在逐个剔除6个吸入性损伤SNP后结果稳定可靠，并非由单个SNP决定。见表3与图3。![]()
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吸入性损伤的病理过程复杂，涉及多种炎症蛋白的变化，而且受到伤情、病程、治疗等多种因素的影响，目前在机制研究、诊断、治疗等方面均存在明显不足［24］。由于伦理的限制，针对吸入性损伤的研究存在样本量小、个体差异大、缺少损伤前指标对照等不足，只能描述相关指标的异常改变，但是无法确定这些变化是由于疾病本身还是其他因素作用的结果。本研究团队依托现有循环炎症蛋白的GWAS开放数据，首次采用双样本MR分析来全面评估吸入性损伤与91种循环炎症蛋白（不必限定血浆还是全血来源）之间的潜在因果关系。在排除年龄、烧伤总面积、性别、肺炎、急性肾损伤和吸烟等混杂因素后，最终明确了吸入性损伤与91种循环炎症蛋白中的4种特定因子（IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9）之间显著的因果关系，即吸入性损伤的发生可引起人体循环血浆蛋白中IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9生成增多。IL-20、IL-19、IL-22、IL-24和IL-26这5种细胞因子共同组成IL-20亚家族［25］。IL-20主要由骨髓细胞产生，有研究指出哮喘患者气道上皮细胞和血清中的IL-20水平升高，提示IL-20可能可以作为反映气道相关疾病和损伤的标志物［26-27］。Barada等［28］观察到暴露于烟雾条件的小鼠气道上皮细胞中IL-20表达增加，提示烟雾可能会引起气道表皮IL-20含量的增加，这与本研究结果相吻合。另外有研究指出IL-20可能会加速2型糖尿病小鼠的创面愈合［29］。但总体而言，目前对于IL-20的研究相对不足，综合前述内容，提示IL-20可能是吸入性损伤疾病发展进程中的关键因子。IL-20RA可以与IL-20RB形成1型IL-20受体，从而特异性结合IL-19、IL-20和IL-24传递其免疫信息；同时，IL-20RA可以与IL-10RB形成IL-26受体，以特异性接收IL-26的信号［30］。有研究表明IL-20RA在肺部高表达，在支气管炎闭塞综合征患者中观察到其IL-20RA含量显著下降，提示IL-20RA可能也是肺部损伤中常见发生改变的因子之一［31-32］。Barada等［28］对46例因肺癌进行肺切除患者远离肿瘤的肺组织进行免疫组织化学分析，根据是否患有慢性阻塞性肺病、是否有吸烟史进行分组对照，结果显示各组间IL-20RA的含量无明显差异，认为其不受吸烟暴露和/或疾病本身的调节。这与本研究的结果相印证：如前所述，IL-20RA不受包括吸烟以内的其他混杂因素的影响。IL-20RA是IL-20的特异性受体的主要组成成分，结合以上研究报道，本研究团队认为IL-20和IL-20RA可能共同参与吸入性损伤致病过程，针对IL-20和IL-20RA的检测及干预，有望为吸入性损伤诊断、治疗、提示预后提供助力。IL-5的作用主要是支持活化B细胞的生长和分化，对参与细胞存活、B细胞成熟的基因以及嗜酸性粒细胞生长、存活和效应功能所需的基因的表达都具有关键性调节作用［33］。目前IL-5被广泛应用于哮喘等呼吸道疾病［34-35］的研究中，但在吸入性损伤领域尚未见相关研究报道。Burbank等［36］对轻度哮喘患者使用过敏原刺激后观察到，其痰液中IL-5的含量明显升高，且IL-5与IL-1β存在正相关关系，但是无法确定两者的因果关系。吸入性损伤可能与哮喘在气道损伤中存在相似的作用机制，仍需进一步研究证实。刘云峰等［37］收集32例重度烧伤合并严重吸入性损伤患者伤后12 h的呼出气体冷凝物，使用液相芯片技术测定其中炎症因子含量，观察到IL-5明显增多。另有研究表明，以IL-5和其他炎症蛋白改变为主的2型免疫反应可以调节人体损伤后的组织修复［38］。以上研究结果可为本研究证实的吸入性损伤与IL-5存在的因果关系提供部分理论支持，提示吸入性损伤发生后机体通过增加IL-5生成加快气道等组织修复。然而，在Finnerty等［39］的研究中，他们对19例不伴有吸入性损伤的严重烧伤患儿炎症蛋白进行检测，观察到包括IL-5在内的多种炎症蛋白含量明显升高，提示IL-5除与吸入性损伤相关之外，还可能受到其他损伤因素的影响。TNFRSF9是TNF受体超家族的成员，通过特定的转导途径在调节细胞死亡、诱导或调控细胞凋亡方面发挥着至关重要的作用［40］，目前主要在肿瘤相关领域［41⁃42］进行研究，在吸入性损伤领域尚未见文献报道。本研究提出吸入性损伤与TNFRSF9存在明确的因果关系，有望为该损伤的机制研究提供新方向，为后续的研究提供有价值的参考。当然，本研究也存在诸多不足。现有的吸入性损伤GWAS数据不包含年龄、性别、具体致伤因素和预后等特定信息，无法对数据进行精确筛选及进一步分类分层分析。同时，由于现有吸入性损伤GWAS数据库中的病例数量有限，后续有必要对更大样本量的吸入性损伤队列进行分析。在双样本MR分析过程中，涉及一个样本和多个样本之间的两两比较，可能会增加二类错误。但是本研究着重关注探究、筛选出吸入性损伤发生后可能导致哪些炎症因子发生变化，为后续的实验和临床验证提供方向，故而使用P<0.05为标准，未使用更为严格的多重矫正。另外，本研究与其他双样本MR研究的不同之处在于没有进行逆向分析，原因在于吸入性损伤作为一种外伤，其在发生原因和发生时间上都具有确定性，不会受到结局的影响，故而不必实施逆向分析。综上所述，本研究在吸入性损伤领域创新性地应用双样本MR分析进行因果关系的研究，对91种炎症蛋白实施筛选，首次明确吸入性损伤与IL-20、IL-20RA、IL-5和TNFRSF9存在显著的因果关系，为深入理解吸入性损伤的病理生理机制，并指导临床治疗提供了重要的参考。当然，本研究仅为初步研究，后续仍需进行进一步基础研究和临床试验验证本研究结论，提供更加翔实可靠的研究成果。作者贡献声明
代站站：研究设计、论文撰写及修改；朱沁：数据分析、图表绘制；佟希睿：研究设计、数据分析；马兵：研究指导与数据采集；夏照帆：研究指导与论文修改；房贺：研究设计、论文指导、经费支持参考文献略
引用本文: 张宇翔,兰美娟,梁诗雨,等.物理性气道廓清技术在吸入性损伤治疗中的应用进展[J].中华烧伤与创面修复杂志,2023,39(5):475-480.DOI:10.3760/cma.j.cn501225-20220608-00226.
引用本文: 蒋勇, 王康安, 王宝丽, 等. 266例合并烧伤总面积小于30%体表总面积的吸入性损伤患者的流行病学特征及结局分析[J]. 中华烧伤杂志, 2021, 37(4): 340-349. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200229-00106.
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