论著 · 脓毒症及其机制研究｜干扰素基因刺激因子对脓毒症状态下小鼠树突状细胞中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4介导铁死亡的影响
文摘
科学
2024-10-09 11:01
北京
干扰素基因刺激因子对脓毒症状态下小鼠树突状细胞中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4介导铁死亡的影响
吴梦瑶 贺鹏翼 段昱 郑丽玉 姚人骐 周岐原 陈钰 董宁 吴瑶 姚咏明
作者单位：解放军总医院医学创新研究部、第四医学中心，北京 100853；解放军总医院第一医学中心普通外科，北京 100853
引用本文：吴梦瑶, 贺鹏翼, 段昱, 等. 干扰素基因刺激因子对脓毒症状态下小鼠树突状细胞中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4介导铁死亡的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(10): 1-10. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240518-00184.
摘要
目的 探讨干扰素基因刺激因子（STING）对脓毒症状态下小鼠树突状细胞（DC）中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）介导铁死亡的影响。
方法 该研究为实验研究。取第3~10代对数生长期的小鼠DC系DC2.4，按随机数字表法（分组方法下同）分为内毒素/脂多糖（LPS）刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激18 h组和LPS刺激24 h组，用1 μg/mL（质量浓度下同）LPS培养相应时间后，采用蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化STING（p-STING）、STING和ACSL4的蛋白表达；将成功转染含STING基因小干扰RNA（siSTING）慢病毒的DC2.4分为siSTING+磷酸盐缓冲液（PBS）组、siSTING+LPS组，将成功转染空载慢病毒的DC2.4分为空载体+PBS组、空载体+LPS组，给予PBS或LPS刺激并培养24 h，同前检测细胞中p-STING、STING和ACSL4的蛋白表达，采用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞脂质过氧化程度，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。以上细胞实验中样本数均为3。将80只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为假手术+生理盐水组、盲肠结扎穿孔（CLP）+生理盐水组、假手术+C-176组、CLP+C-176组，每组20只。对2个C-176组小鼠先经腹腔注射C-176、2个生理盐水组小鼠先经腹腔注射等量生理盐水，然后对2个假手术组小鼠行假手术、对2个CLP组小鼠行CLP术构建脓毒症模型。术后24 h，将每组10只小鼠处死后提取脾脏DC，同前行蛋白表达、脂质过氧化程度、凋亡率检测；另行苏木精-伊红染色观察小鼠心、肝、肺、肾病理组织损伤。观察各组剩余10只小鼠术后7 d内存活情况。
结果 LPS刺激24 h组DC2.4中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达及p-STING/STING比值均明显高于LPS刺激0 h组（P<0.05）。培养24 h后，siSTING+LPS组和空载体+PBS组DC2.4中p-STING、STING和ACSL4的蛋白表达均明显低于空载体+LPS组（P<0.05）；siSTING+LPS组和空载体+PBS组DC2.4脂质过氧化程度均弱于空载体+LPS组；空载体+PBS组、空载体+LPS组、siSTING+PBS组与siSTING+LPS组DC2.4凋亡率分别为（15.7±3.0）%、（37.8±2.9）%、（13.1±2.1）%与（20.6±1.8）%，其中空载体+PBS组、siSTING+LPS组DC2.4凋亡率均明显低于空载体+LPS组（P<0.05）。术后24 h，CLP+生理盐水组小鼠脾脏DC中p-STING、ACSL4的蛋白表达及p-STING/STING比值均明显高于假手术+生理盐水组和CLP+C-176组（P<0.05），CLP+生理盐水组小鼠脾脏DC中STING的蛋白表达明显高于假手术+生理盐水组（P<0.05）；CLP+C-176组和假手术+生理盐水组小鼠脾脏DC脂质过氧化程度均弱于CLP+生理盐水组；假手术+生理盐水组、CLP+C-176组小鼠脾脏DC凋亡率均明显低于CLP+生理盐水组（P<0.05），CLP+C-176组小鼠脾脏DC凋亡率明显高于假手术+C-176组（P<0.05）；CLP+生理盐水组小鼠心、肝、肺、肾病理组织损伤均较假手术+生理盐水组明显加重，CLP+C-176组小鼠各脏器上述病理组织损伤均较CLP+生理盐水组明显减轻。CLP+生理盐水组小鼠术后7 d内存活比明显低于假手术+生理盐水组（χ2=8.30，P<0.05）。
结论 脓毒症状态下，小鼠DC内STING活化显著，ACSL4介导的铁死亡增强；抑制STING活化能够显著降低脓毒症时小鼠DC内ACSL4介导的铁死亡水平，从而改善脓毒症小鼠存活情况。
关键词：脓毒症；免疫调节；细胞死亡；树突细胞；铁死亡；干扰素基因刺激因子；酰基辅酶A合成酶长链家族成员4
干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）是一种定位于内质网膜的模式识别受体［1］，其活化后能够通过诱导干扰素调节因子3和核因子κB活化，促进Ⅰ型干扰素及多种炎症细胞因子产生［2］。业已明确，STING活化是机体抗病毒免疫的重要途径［3-4］，其异常激活与多条细胞程序性死亡信号通路密切相关［5-6］。铁死亡是近年来新发现的程序性细胞死亡方式，细胞膜的过度脂质过氧化是铁死亡最明显的特征。本研究团队前期研究显示，脓毒症状态下小鼠树突状细胞（dendritic cell，DC）可发生铁死亡，并致使机体呈现严重免疫失调反应［7］。然而，关于STING对于脓毒症状态下DC铁死亡的调控效应目前仍不清楚。本研究旨在探讨脓毒症状态下小鼠脾脏DC中STING活化水平的变化规律，并通过干预STING活化观察抑制STING对于DC中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）介导铁死亡的影响，为脓毒症免疫精准治疗提供新思路。本实验研究经解放军总医院实验动物伦理审查委员会批准，实验操作严格遵守该委员会相关规定。小鼠DC系DC2.4购自北京乾兆信业生物科技有限公司。80只6~8周龄体重约20 g健康无特殊病原体级雄性野生型C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0008。含STING基因小干扰RNA（stimulator of interferon gene small interfering RNA，siSTING）慢病毒、空载慢病毒及慢病毒转染试剂盒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。RPMI1640培养基购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，PBS购自天津灝洋华科生物科技有限公司，LPS购自美国Sigma-Aldrich公司，STING强效共价抑制剂C-176和Hoechst 33342染料购自美国MCE公司，免疫分离试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司，兔抗小鼠STING单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗小鼠磷酸化STING（phosphorylated stimulator of interferon gene，p-STING）单克隆抗体、兔抗小鼠ACSL4单克隆抗体购自美国CST公司，小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体购自北京华兴博创基因技术有限公司，脂质过氧化检测试剂盒、超敏化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，膜联蛋白Ⅴ-藻红蛋白/7-氨基放线菌素D检测试剂盒、膜联蛋白Ⅴ-别藻蓝蛋白/7-氨基放线菌素D检测试剂盒、CANTO PLUS型流式细胞仪均购自美国BD公司。DYY-7型蛋白电泳仪购自北京六一仪器厂，ImageQuant LAS 4000型化学发光成像分析仪购自美国GE通用电气公司，Spectra MR型多功能酶标仪购自美国DYNEX Technologies公司，Leica CTR4000型倒置荧光相差显微镜、Leica SP5型激光扫描共聚焦显微镜购自德国Leica公司。采用T25培养瓶培育小鼠DC系DC2.4，加入8 mL含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、5 958 mg/L缓冲剂和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基（以下称为完全培养基），置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中进行常规培养。每2天换液，待细胞融合度达80%时传代，取第3~10代对数生长期的细胞进行实验。1.2.2 LPS刺激后细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达检测将细胞按随机数字表法（分组方法下同）分为LPS刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激18 h组和LPS刺激24 h组，用1 μg/mL（质量浓度下同）LPS培养相应时间后，收集每组细胞约2×106个（细胞数下同），提取细胞总蛋白后，采用蛋白质印迹法检测细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达。一抗为兔抗小鼠STING单克隆抗体、兔抗小鼠p-STING单克隆抗体、兔抗小鼠ACSL4单克隆抗体和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000）；二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体和HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体（稀释比均为1∶5 000）。采用超敏化学发光试剂盒显影、成像，化学发光成像分析仪观察后，采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）分析目的蛋白灰度值，将β肌动蛋白作为内参照，计算目的蛋白相对表达量，另计算p-STING/STING比值。该实验样本数为3。将细胞以3×104个/mL重新悬浮于完全培养基中，按每孔2 mL接种于6孔板中，分为转染空载慢病毒的空载体组以及转染含siSTING慢病毒的siSTING组。参照慢病毒转染试剂盒说明书中的基因转染方法，将细胞与相应慢病毒共培养24 h后，更换新的完全培养基，另将仅常规培养的细胞设为空白对照组。继续培养72 h后（即转染后72 h）在倒置荧光相差显微镜200倍放大倍数下观察细胞的绿色荧光蛋白携带状态，其中能够携带绿色荧光蛋白且活力较好的细胞为成功转染慢病毒的细胞。收集细胞用于后续实验。1.2.4 干预STING基因对LPS刺激下DC2.4内ACSL4介导细胞铁死亡的影响1.2.4.1 细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达检测把成功转染空载慢病毒的细胞分为空载体+PBS组、空载体+LPS组，把成功转染含siSTING慢病毒的细胞分为siSTING+PBS组、siSTING+LPS组，对2个PBS组细胞给予PBS刺激、2个LPS组细胞给予等量LPS刺激。培养24 h后，收集细胞同1.2.2采用蛋白质印迹法检测细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达。该实验样本数为3。取1.2.4.1中培养24 h后的细胞，采用脂质过氧化检测试剂盒及Hoechst 33342染料染色30 min后，于激光扫描共聚焦显微镜630倍放大倍数下观察细胞荧光表达情况。还原态细胞呈红色，发生脂质过氧化细胞呈绿色，绿色荧光越强，提示细胞脂质过氧化反应越明显。取1.2.4.1中培养24 h后的细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。该实验样本数为3。将80只小鼠分为假手术+生理盐水组、盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）+生理盐水组、假手术+C-176组、CLP+C-176组，每组20只。于术前1 h，对2个C-176组小鼠经腹腔注射终物质的量浓度为750 nmol/L的C-176，对2个生理盐水组小鼠经腹腔注射等量生理盐水。参照文献［19］对2个假手术组小鼠行假手术，对2个CLP组小鼠行CLP术构建脓毒症模型。术后，每组各取10只小鼠另安置于新鼠笼，于术后24 h行脱颈法处死后，采用免疫分离法提取小鼠脾脏DC备用；留取小鼠心、肝、肺、肾脏器组织，常规制成厚度为4~5 μm的切片备用。对每组剩余各10只小鼠进行7 d内生存状态观察。1.3.2 抑制STING活化对脓毒症状态下小鼠脾脏DC内ACSL4介导铁死亡的影响1.3.2.1 细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达检测取1.3.1中细胞，同1.2.2采用蛋白质印迹法检测细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达。该实验样本数为3。取1.3.1中细胞，同1.2.4.2采用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞脂质过氧化程度。取1.3.1中细胞，同1.2.4.3采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。该实验样本数为3。取1.3.1中小鼠心、肝、肺、肾组织切片，进行HE染色，于倒置荧光相差显微镜200倍放大倍数下观察小鼠脏器病理组织损伤。取1.3.1中每组剩余的10只小鼠，观察小鼠术后1~7 d的存活状况，计算每天的存活比。采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以![]()
表示，单因素下组间总体比较行单因素方差分析，组间两两比较行Dunnett检验；多因素下组间总体比较行析因设计方差分析，单独效应行单因素方差分析和LSD检验。计数资料数据采用频数（比）表示，多组间总体比较及两两比较采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。2.1 LPS刺激后DC2.4中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达
LPS刺激24 h组细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达及p-STING/STING比值均明显高于LPS刺激0 h组（P<0.05）。见表1、图1。![]()
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转染后72 h，空载体组和siSTING组细胞均携带高强度绿色荧光蛋白，而空白对照组细胞在相同时间点无荧光表现。见图2。![]()
2.3 干预STING基因对LPS刺激下DC2.4内ACSL4介导细胞铁死亡的影响
2.3.1 细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达培养24 h后，siSTING+LPS组和空载体+PBS组细胞中p-STING、STING和ACSL4的蛋白表达均明显低于空载体+LPS组（P<0.05）。见图3、表2。![]()
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培养24 h后，siSTING+LPS组和空载体+PBS组细胞脂质过氧化程度均弱于空载体+LPS组，siSTING+LPS组细胞脂质过氧化程度与siSTING+PBS组相近。见图4。![]()
培养24 h后，空载体+PBS组、空载体+LPS组、siSTING+PBS组与siSTING+LPS组细胞凋亡率分别为（15.7±3.0）%、（37.8±2.9）%、（13.1±2.1）%与（20.6±1.8）%（刺激类型的主效应，F=87.61，P=0.011；细胞转染类型的主效应，F=51.22，P=0.019；二者交互作用，F=26.58，P=0.035）。空载体+PBS组、siSTING+LPS组细胞凋亡率均明显低于空载体+LPS组（P值分别为0.020、0.033），siSTING+LPS组与siSTING+PBS组细胞凋亡率相近（P=0.152）。2.4 抑制STING活化对脓毒症状态下小鼠脾脏DC中ACSL4介导铁死亡的影响
2.4.1 细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达术后24 h，CLP+生理盐水组小鼠细胞中p-STING、ACSL4的蛋白表达及p-STING/STING比值均明显高于假手术+生理盐水组和CLP+C-176组（P<0.05），CLP+生理盐水组小鼠细胞中STING的蛋白表达明显高于假手术+生理盐水组（P<0.05）。见图5、表3。![]()
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术后24 h，CLP+C-176组和假手术+生理盐水组小鼠细胞脂质过氧化程度均弱于CLP+生理盐水组，CLP+C-176组小鼠细胞脂质过氧化程度与假手术+C-176组相近。见图6。![]()
术后24 h，假手术+生理盐水组、假手术+C-176组、CLP+生理盐水组与CLP+C-176组小鼠细胞凋亡率分别为（59.1±3.4）%、（54.0±2.9）%、（86.4±0.8）%与（74.3±3.0）%（造模类型的主效应，F=975.20，P=0.001；抑制剂类型的主效应，F=15.48，P=0.058；二者交互作用，F=3.67，P=0.195）。假手术+生理盐水组、CLP+C-176组小鼠细胞凋亡率均明显低于CLP+生理盐水组（P值分别为0.008、0.042），CLP+C-176组小鼠细胞凋亡率明显高于假手术+C-176组（P=0.015）。术后24 h，CLP+生理盐水组小鼠心、肝、肺、肾病理组织损伤均较假手术+生理盐水组明显加重，其中，心肌纤维排列紊乱，肝索结构紊乱，肺泡壁增厚、水肿，肾小管肿胀、有明显炎性细胞浸润；CLP+C-176组小鼠各脏器上述病理组织损伤均较CLP+生理盐水组明显减轻。假手术+生理盐水组和假手术+C-176组各脏器组织结构均无明显变化。术后7 d内，4组小鼠存活比比较，差异有统计学意义（χ2=14.37，P=0.002），CLP+生理盐水组小鼠术后7 d内存活比明显低于假手术+生理盐水组（χ2=8.30，P=0.004），CLP+C-176组小鼠术后7 d内存活比与假手术+C-176组、CLP+生理盐水组小鼠相近（χ2值分别为3.36、1.51、P值分别为0.067、0.218）。见图7。![]()
铁死亡是基于细胞内代谢通路紊乱而诱发的细胞死亡方式，与细胞脂质代谢尤为相关［8］。ACSL4是参与多不饱和脂肪酸-磷脂酰乙醇胺在细胞膜内生物合成和重塑的关键脂质代谢酶［9-11］，在诱导细胞发生铁死亡中具有重要作用［12-15］。DC作为机体免疫系统中重要的“桥梁”细胞［16］，其功能状态及数量减少是影响脓毒症免疫应答的关键［17-19］。本研究团队前期研究显示，DC铁死亡是导致脓毒症状态下机体免疫反应失调的重要机制，当DC铁死亡程度加重时，DC凋亡率增加，数量明显减少，脓毒症小鼠呈现更严重的免疫抑制和更高的死亡率；而抑制DC铁死亡则能够维持DC免疫功能稳态，明显缓解脓毒症小鼠免疫抑制状态［7］。作为直接的免疫传感器，STING被激活后能够促进多种炎症细胞因子的合成与释放，从而调节机体免疫应答，STING还被证明可介导多种细胞程序性死亡过程。有研究证实，脓毒症小鼠模型中线粒体DNA增加可通过STING信号通路驱动小鼠肝脏库普弗细胞内坏死性凋亡程序［20］；Hu等［21］在脓毒症小鼠肠上皮细胞中也观察到STING依赖的凋亡信号通路活化。另据报道，STING过度激活还可诱导患者弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞泛凋亡的发生［22］。上述研究均提示，STING在识别和放大由死亡细胞引发免疫反应方面发挥重要调节作用［23-24］。许多研究证明，STING可通过多重途径诱导细胞铁死亡［25-27］，除了STING-干扰素调节因子3信号通路外，有资料提示，STING还可通过与核受体共激活因子4相互作用来诱导巨噬细胞铁死亡，进而加剧脓毒症所致多器官损伤［28-29］。基于此，本研究观察了脓毒症状态下小鼠DC2.4中的p-STING、STING和ACSL4动态活化规律，与LPS刺激0 h组比较，LPS刺激24 h组小鼠DC2.4中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达均明显升高，故后续将24 h作为LPS刺激时间点。一项关于高血压相关慢性肾脏病的研究显示，STING可与ACSL4结合并通过靶向ACSL4介导的铁死亡途径，诱导小鼠巨噬细胞铁死亡［29］。为了深入探究脓毒症状态下STING对于DC内ACSL4介导铁死亡的潜在影响，本研究团队对小鼠DC2.4转染含siSTING慢病毒和空载慢病毒，并检测细胞中p-STING、STING、ACSL4的蛋白表达及铁死亡情况。结果证实，培养24 h后，siSTING+LPS组小鼠DC2.4内ACSL4的蛋白表达、脂质过氧化程度及细胞凋亡率均明显低于空载体+LPS组，表明脓毒症状态下，抑制STING表达能够有效缓解小鼠DC2.4内ACSL4介导的铁死亡的发生。本研究团队进一步采用CLP术构建脓毒症模型小鼠，并给予STING强效共价抑制剂C-176干预，在动物水平验证干预STING活化对脓毒症时小鼠DC内ACSL4介导铁死亡的影响。结果提示，术后24 h，CLP+C-176组小鼠脾脏DC中p-STING/STING比值明显低于CLP+生理盐水组，提示STING活化被有效抑制，同时细胞内ACSL4的蛋白表达水平、脂质过氧化程度及细胞凋亡率也明显降低，表明抑制STING活化后，脓毒症小鼠脾脏DC内ACSL4介导的铁死亡被显著缓解。HE染色结果提示，CLP+C-176组小鼠术后24 h心、肝、肺、肾组织病理损伤程度均较CLP+生理盐水组明显减轻；CLP+生理盐水组小鼠术后7 d内存活比明显低于假手术+生理盐水组，CLP+C-176组小鼠术后7 d内存活比与CLP+生理盐水组相近（P>0.05）。由此可见，在脓毒症状态下，STING能通过ACSL4对DC铁死亡发挥促进效应，进而导致脓毒症动物生存率的下降。另据报道，在狼疮性肾炎患者肾组织细胞中，抑制STING表达可明显降低ACSL4的蛋白表达水平，减轻细胞脂质过氧化程度，缓解细胞铁死亡，从而使机体肾组织损伤程度明显好转［30］。这与本实验中观察到的结果基本相符，进一步验证了STING对于ACSL4介导细胞铁死亡的调控作用。值得说明的是，尽管本研究和其他研究已证实STING活化在ACSL4介导铁死亡中的重要作用，但脓毒症状态下STING通过ACSL4轴调节DC铁死亡的确切信号机制亟待探索。此外，本研究目前仅针对STING活化抑制对于脓毒症状态下DC铁死亡的影响进行探索，尚缺乏阐明脓毒症下过度激活STING对DC铁死亡水平的调控作用；下一步将构建含STING基因过表达RNA慢病毒及STING基因过表达小鼠模型，从多角度多层次深入探究脓毒症状态下DC内STING与ACSL4介导铁死亡之间的本质联系。本研究结果表明，STING对于脓毒症状态下小鼠DC内ACSL4介导铁死亡具有明显促进效应，干预STING活化有助于调节脓毒症时ACSL4介导的小鼠DC铁死亡的发生发展进程，进而改善脓毒症小鼠存活比。该研究将为阐明脓毒症免疫应答失调机制及其精准调理策略开辟新方向。作者贡献声明
吴梦瑶：实施研究、起草文章；贺鹏翼、段昱、郑丽玉、姚人骐：实施研究、采集数据；周岐原、陈钰：分析/解释数据；董宁、吴瑶：统计分析、技术支持；姚咏明：研究指导、论文修改、经费支持参考文献略
引用本文: 姚咏明, 张卉, 吴瑶. 靶向树突状细胞的脓毒症免疫调理新策略[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2023, 39(7): 606-611. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230321-00087.
引用本文: 孙炳伟, 王逸凡, 杨云稀. 中性粒细胞与烧伤脓毒症[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(7): 618-624. DOI:10.3760/cma.j.cn501225-20240329-00109.
引用本文: 段昱, 姚人骐, 郑丽玉, 等. 序列相似性家族134成员B介导的内质网自噬对内毒素/脂多糖诱导的小鼠树突状细胞凋亡的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2023, 39(9): 857-866. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230227-00063.
引用本文: 王运帷, 刘洋, 曹鹏, 等. Krüppel样因子4对脓毒症小鼠炎症反应与脏器损伤的作用[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(11): 1047-1056. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220111-00005.
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