视频摘要文章｜论著｜肥胖患者减重成功后脂肪干细胞的生物学特性变化
文摘
科学
2024-11-11 17:00
北京
作者单位：郑州大学第一附属医院整形外科，郑州 450052；德国海德堡大学医学院普通、内脏和器官移植外科，海德堡 69120
引用本文：魏志茹, 董炎, 乔改红, 等. 肥胖患者减重成功后脂肪干细胞的生物学特性变化[J]. 中华烧伤与创面修复杂志. Doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20231205-00225.
摘要
目的 探索肥胖患者减重成功后脂肪干细胞（ASC）的生物学特性变化，为该类ASC在难愈性创面修复中的临床应用提供参考。
方法 该研究为实验研究。将2021年4月—2023年4月郑州大学第一附属医院收治的12例肥胖减重成功行腹壁皮肤松弛矫正术的患者纳入减重组［女8例、男4例，年龄为（50±9）岁］，同期招募该单位收治的行腹部抽脂后面部填充的12名健康志愿者纳入健康组［女10例、男2例，年龄为（50±9）岁］。收集减重组患者与健康组志愿者的脂肪组织并提取ASC，取第4、5代对数生长期ASC进行实验。于培养0（即刻）、24、48、72 h，采用噻唑蓝法检测细胞增殖水平。行细胞划痕试验，计算划痕后12、24 h细胞迁移率。行细胞Transwell试验，培养24 h后计数迁移细胞。行成脂诱导、成骨诱导实验，分别于培养18、21 d后观测细胞成脂、成骨分化水平。采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中脂蛋白脂肪酶（LPL）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、Runt相关转录因子2（Runx2）、骨桥蛋白、碱性磷酸酶（ALP）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、转化生长因子β（TGF-β）的mRNA表达。各实验样本数均为12。
结果 培养0 h，减重组患者与健康组志愿者细胞增殖水平分别为1.022±0.056、1.000±0.144，组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。培养24、48、72 h，减重组患者细胞增殖水平分别为1.366±0.030、1.353±0.012、1.390±0.016，明显低于健康组志愿者的1.755±0.077、1.737±0.014、1.700±0.023（t值分别为16.27、71.35、38.56，P值均<0.05）。划痕后12、24 h，减重组患者细胞迁移率均低于健康组志愿者，但差异均无统计学意义（P>0.05）。细胞Transwell试验中，培养24 h后，健康组志愿者和减重组患者细胞迁移数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。成脂诱导18 d后，减重组患者细胞成脂分化水平明显低于健康组志愿者（t=27.81，P<0.05）；成骨诱导21 d后，减重组患者细胞成骨分化水平明显低于健康组志愿者（t=14.85，P<0.05）。与健康组志愿者比较，减重组患者细胞中LPL、PPARγ、TGF-β和Runx2的mRNA表达均明显降低（t值分别为59.48、146.10、46.10、3.13，P<0.05），而骨桥蛋白、ALP和MMP-9的mRNA表达均无明显变化（P>0.05）。
结论 相对于健康志愿者，肥胖减重成功患者ASC的增殖功能明显减弱，分化功能相对较弱，与成脂、成骨分化对应的部分基因表达水平下降，这可能会影响其治疗由烧伤、糖尿病和放射性损伤等导致的难愈性创面的效果，故在临床应用时，需要考虑ASC的供体差异。
关键词：肥胖；体重减轻；细胞增殖；脂肪干细胞；成骨分化；成脂分化
脂肪干细胞来源丰富、取材方便、获取创伤小、无自体免疫排斥反应且有多向分化潜能，被视为组织工程学极具前景的干细胞之一［1］。脂肪干细胞及其外泌体均可促进创面愈合。供体因素，包括身高、体重、性别和年龄都会影响脂肪干细胞的多能性［2］。根据美国肥胖医学协会的定义：肥胖是一种慢性、复发性、多因素的神经行为疾病。随着脂肪的增加，患者出现脂肪组织功能障碍和体型改变，导致代谢异常、活动受限及病态社会心理等情况［3-4］。肥胖患者脂肪干细胞（adipose-derived stem cell，ASC）增殖能力下降、功能受损、极易老化［5］、促进创面愈合能力下降［6］，故肥胖患者创面愈合缓慢。目前，对肥胖患者减重到正常水平时其ASC的研究较少［7］。本实验通过收集肥胖减重成功患者脂肪组织，提取其ASC，观察其生物学特性变化，为该类ASC在由烧伤、糖尿病和放射性损伤等导致的难愈性创面修复中的临床应用提供参考。本实验研究方案经郑州大学第一附属医院（以下称为本单位）伦理委员会批准（批号：2021-KY-0421-002），标本获取经患者/健康志愿者知情同意。DMEM培养基、细胞过滤器购自德国莱比信公司，噻唑蓝、二甲基亚砜、油红O、茜素红、胎牛血清、PBS、DMEM高糖培养基购自德国默克公司，二氧化碳细胞培养箱、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher Scientific公司，反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自美国普洛麦格公司，成脂分化培养基、成骨分化培养基均购自上海启达生物科技有限公司。低温台式离心机购自德国艾本德公司，Transwell小室购自美国康宁公司，Observer. Z1型光学显微镜和Image.M2型倒置相差显微镜均购自德国蔡司公司。纳入标准：减重组，肥胖病史（体重指数>28 kg/m2）超过1年，行垂直袖状胃切除术后体重指数降至正常范围，体重指数维持正常至少1年，行腹壁皮肤松弛矫正术；健康组，既往无肥胖病史，身体健康，行腹部抽脂后面部填充术。所有研究对象具有良好的依从性，自愿参加本研究，签订知情同意书，被纳入研究时体重指数≥18.5 kg/m2且<24 kg/m2，年龄18周岁以上，性别不限。排除标准：有全身合并症，如血液病、肿瘤、心肺肝肾功能严重不全、糖尿病、高血压等。临床资料及分组：将2021年4月—2023年4月本单位收治的12例肥胖减重成功行腹壁皮肤松弛矫正术的患者纳入减重组，同期招募本单位收治的行腹部抽脂后面部填充的12名健康志愿者纳入健康组。减重组患者与健康组志愿者性别、年龄和体重指数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。![]()
于术后12 h内，收集每例减重组患者与每名健康组志愿者的20 g术后弃用脂肪组织，进行细胞提取。将脂肪组织按照常规方法剪碎、消化、过滤、离心后，用含体积分数10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基（以下称完全培养基）悬浮细胞。将细胞接种于底面积为75 cm2的细胞培养瓶中，24 h后换液，之后每2天换液1次。待细胞生长至80%~90%融合时开始传代，后续实验用第4、5代细胞［8］。后续实验样本数均为12。将减重组患者与健康组志愿者的第4代ASC以1×104个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔100 μL，用完全培养基培养。分别于培养0（即刻）、24、48、72 h，每孔加入10 μL噻唑蓝溶液孵育4 h，弃去孔内培养上清液后，每孔加入100 μL二甲基亚砜，振荡10 min，采用酶标仪检测490 nm波长处吸光度值，以此表示细胞增殖水平。将减重组患者与健康组志愿者的第4代ASC以3×105个/mL的浓度接种于6孔板中，每孔2 mL，用完全培养基培养。当细胞生长至80%~90%融合时，以规格为1 mL移液枪枪头垂直向下在培养孔底划1条横线，吸去培养基，用PBS清洗3次。分别于划痕后0（即刻）、12、24 h，在光学显微镜50倍放大倍数下观察划痕面积并拍照，采用ImageJ1.51图像分析软件（美国国立卫生研究院）计算划痕后12、24 h的细胞迁移率。细胞迁移率=（划痕后0 h划痕面积-划痕后其他时间点划痕面积）÷划痕后0 h划痕面积×100%。1.3.3.2 细胞Transwell试验检测细胞垂直迁移情况取减重组患者与健康组志愿者的第4代ASC，以无血清完全培养基重新悬浮，配制细胞浓度为1×105个/mL的细胞悬液。选用孔径8 μm的Transwell小室，其中下室加入600 μL的完全培养基，上室加入100 μL上述配制的细胞悬液，培养24 h。取小室浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中，固定30 min，以苏木精染色，在倒置相差显微镜200倍放大倍数下观察细胞迁移（阳性染色为蓝色）情况。每个样本取3个视野，统计迁移至下室的细胞数，结果取均值。取减重组患者与健康组志愿者的第5代ASC同1.3.3.1接种培养，待细胞生长至100%融合后，更换为成脂分化或成骨分化培养基。成脂分化培养基干预18 d后使用油红O进行染色，于倒置相差显微镜200倍放大倍数下观察诱导结果并拍照；成骨分化培养基干预21 d后使用茜素红进行染色，于倒置相差显微镜100倍放大倍数下观察诱导结果并拍照。油红O染色并拍照后，以体积分数60%异丙醇洗脱样品，使用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度值。茜素红染色并拍照后，每孔加入800 μL体积分数为10%的乙酸，常规离心后吸取500 μL上清液，加入200 μL体积分数为10%的氢氧化铵，使用酶标仪测定405 nm波长处的吸光度值。以吸光度值表示细胞成脂、成骨分化水平。取减重组患者与健康组志愿者的第5代ASC同1.3.3.1接种培养，待细胞生长达80%~90%融合时，提取细胞总RNA并测定浓度，取1 μg RNA，利用反转录酶合成互补DNA［9］。引物序列由上海生工生物工程有限公司设计并合成，引物序列和产物大小见表2。以18S核糖体为内参照，采用实时荧光定量RT-PCR法检测Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨桥蛋白、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、TGF-β、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ）及基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的mRNA表达。基于Δ循环阈值对上述所检测因子mRNA表达进行定量。以内参照结果为1，计算减重组患者与健康组志愿者细胞相应细胞因子mRNA表达量的相对值。![]()
采用SPSS 26.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料数据以![]()
表示，多个时间点组间总体比较行析因设计方差分析、重复测量方差分析，2组间比较行独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料数据以M（Q1，Q3）表示，组间比较行Mann-Whitney U检验。计量资料数据以频数表示，行Fisher确切概率法检验。P<0.05为差异有统计学意义。培养0 h，减重组患者与健康组志愿者细胞增殖水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；培养24、48、72 h，减重组患者细胞增殖水平均明显低于健康组志愿者（P<0.05）。见表3。![]()
划痕后12、24 h，减重组患者细胞迁移率均低于健康组志愿者，但差异均无统计学意义（P>0.05），见图1和表4。![]()
![]()
培养24 h后，减重组患者与健康组志愿者细胞迁移数分别为（57±3）、（56±3）个，组间比较，差异无统计学意义（t=0.39，P=0.703），见图2。![]()
成脂诱导18 d后，减重组患者与健康组志愿者的细胞都逐渐出现串珠样堆积的脂滴，油红O染色后观察到被染成红色的脂滴。减重组患者细胞成脂分化水平为1.35±0.05，明显低于健康组志愿者的1.85±0.04（t=27.81，P<0.001）。成骨诱导21 d后，减重组患者与健康组志愿者的细胞均可见棕褐色钙化结节形成，茜素红染色后可见红色结节。减重组患者细胞成骨分化水平为0.245±0.016，明显低于健康组志愿者的0.343±0.016（t=14.85，P<0.001）。见图3。![]()
与健康组志愿者比较，减重组患者细胞中LPL、PPARγ、TGF-β和Runx2的mRNA表达均明显降低（P<0.05），而骨桥蛋白、ALP和MMP-9的mRNA表达均无明显变化（P>0.05），见表5。![]()
ASC易提取易培养，无免疫诱导性，具有多方面的再生潜力和免疫调节能力，ASC及其衍生物目前被广泛应用于组织工程和慢性创面治疗的机制研究［10-11］。有研究者报道ASC是创面愈合和组织再生最理想的干细胞之一［12-13］，可通过释放外泌体、细胞因子和生长因子，显著增强细胞增殖、血管生成、胶原蛋白合成和组织再生［8］。也有很多研究关注ASC衍生产物在慢性难愈性创面愈合中的作用［14-15］，如有研究者报道人ASC及其外泌体可有效加速糖尿病患者慢性溃疡愈合［10］；另有研究者报道人ASC条件培养基可促进糖尿病大鼠感染创面的愈合，且ASC不涉及伦理问题，自体ASC及其衍生物应用也避免了免疫排斥反应［7］。然而，研究显示，供体临床特征与ASC功能息息相关［16-17］。有研究表明，ASC功能具有年龄依赖性，随着年龄增长，小鼠ASC潜在分化和组织修复能力减弱［18］；另有研究证实人ASC分化能力与性别无关［19］；还有研究证实，溃疡性结肠炎患者的ASC表现出免疫抑制缺陷，其增殖、分化能力低于健康人的ASC［20］。肥胖患者ASC功能下降在很多研究中都得到了证实。肥胖是糖尿病的诱导因素，肥胖患者的创面愈合缓慢［21-22］，导致其愈合缓慢的原因之一如下：长期肥胖的患者，体内微环境处于慢性炎症状态，机体ASC出现早衰［23-24］，增殖速度低于健康人的ASC［25］，肥胖患者的ASC的IL-1、IL-6和TNF-α表达上调，而增加的TNF-α可加速ASC的衰老［26-27］，进而使ASC出现分化能力差［28］。另有研究表明，人肥胖脂肪组织中PPARγ表达减少，也可导致其ASC功能受损［29］。Griesche等［30］的研究结果也验证了人体重指数增高的情况下，ASC增殖能力下降。同样 Frazier等［31］研究证实肥胖减弱机体ASC增殖能力并损伤其成骨能力。而关于减重方式不同和减重至正常体重时，ASC功能能否恢复至正常状态尚鲜见相关研究。在本研究中，细胞增殖实验和分化实验结果提示：减重组患者ASC增殖能力及分化能力均弱于健康组志愿者，与之对应的在基因水平上，成骨分化相关因子Runx2和成脂分化相关因子LPL、PPARγ的mRNA表达降低。本文研究对象中肥胖患者在减重时行垂直袖状胃切除术，摄食减少，术后1~2年内快速减重60%，且标本获取时间为减重成功1年左右，即减重成功后维持时间较短，肥胖导致的炎症状态并未完全消失，故ASC的增殖分化能力并不能完全恢复。而减重组患者与健康组志愿者ASC中成骨分化相关因子骨桥蛋白和ALP的表达差异均无统计学意义（P>0.05），表明减重组患者的分化相关因子已有部分表达量增加，其分化功能或许处在恢复期的过渡阶段。而划痕试验及Transwell试验结果提示：减重组患者与健康组志愿者ASC的迁移能力差异无统计学意义（P>0.05）。MMP-9表达与细胞迁移、转移能力相关［32］。减重组患者与健康组志愿者ASC中MMP-9的mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），与划痕试验和Transwell试验结果相符。考虑因垂直袖状胃切除手术可减轻促炎因子负担同时使抗炎因子分泌增多［33-34］，体内炎症状态改善，ASC迁移功能可能在逐渐恢复。在皮肤创面愈合过程中，TGF-β在促进KC的迁移和上皮再生中扮演关键角色［35］。相比减重组患者，健康组志愿者ASC表现出明显增强的TGF-β表达，这意味着在使用减重组患者ASC及其衍生物治疗创面时的疗效可能会受到一定程度的限制。还有其他因素，如患者的生活方式、遗传背景、环境暴露等，是记录中无法获得的患者临床特征，可能会对本研究的结果造成一定的影响。本实验从腹部获取脂肪组织进行研究，减重组患者与健康组志愿者年龄、性别、体重指数相近，2组实验对象主要的临床特征区别为肥胖病史。因此，本团队推断减重组患者与健康组志愿者部分实验结果的差异性可能是由肥胖病史的影响所致。本次实验结果证明，对比健康组志愿者，减重组患者ASC的增殖能力较低、迁移能力相当、分化能力下降，因此肥胖病史导致的ASC的损伤短期内或许是不可逆的。基于本次实验样本数限制及供体之间的差异，未来可对比同一供体体重指数改变前后ASC功能变化，为ASC临床应用提供更好的基础。选择合适的ASC及其衍生物供体对于治疗慢性溃疡至关重要，在进行供体选择时需要考虑现病史和既往史，以确保治疗的有效性和安全性。作者贡献声明
魏志茹：酝酿并设计实验、实施研究、采集数据、分析数据、撰写论文；董炎：采集数据、分析数据、修改论文；乔改红、刘林嶓：分析数据、修改论文；李广帅：指导研究、修改论文、获取研究经费参考文献略
引用本文: 曹涛, 郝彤, 肖丹, 等. 人脂肪干细胞外泌体对糖尿病周围神经病变的作用及其机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(3): 240-248. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20231207-00230.
引用本文: 刘颖, 程凤, 王泽薇, 等. 负载小鼠脂肪干细胞的甲壳素/透明质酸/胶原水凝胶的制备及其对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的作用[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(1): 50-56. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230928-00101.
本文为《中华烧伤与创面修复杂志》原创文章，版权归中华医学会所有。其他媒体、网站、公众号等如需转载本文，请联系本刊编辑委员会获得授权，并在文题下醒目位置注明“原文刊发于《中华烧伤与创面修复杂志》，卷（期）：起止页码”。谢谢合作！
感谢您对本刊的关注与支持！
![]()
广告
![]()
