论著 · 脓毒症及其机制研究｜脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1对模拟脓毒症状态下小鼠树突状细胞铁死亡的作用
文摘
科学
2024-10-09 11:01
北京
脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1对模拟脓毒症状态下小鼠树突状细胞铁死亡的作用
作者单位：河北医科大学第二医院急诊医学科，石家庄 050000；解放军总医院医学创新研究部、第四医学中心，北京 100853
引用本文：周岐原, 李京宴, 姚咏明, 等. 脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1对模拟脓毒症状态下小鼠树突状细胞铁死亡的作用[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(10): 1-10. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240430-00159.
摘要
目的 探讨脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1（APE1）对模拟脓毒症状态下小鼠树突状细胞（DC）铁死亡的作用，为改善创面感染等引起的脓毒症免疫抑制提供依据。
方法 该研究为实验研究。取第3~10代对数生长期的小鼠DC系DC2.4进行研究（样本数均为3），采用1 μg/mL内毒素/脂多糖（LPS，浓度下同）处理DC 0（未处理）、6、12、24、48、72 h构建脓毒症模型，采用蛋白质印迹法检测细胞中APE1及抗铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）蛋白表达，采用流式细胞术检测细胞中活性氧水平，采用活细胞成像技术检测细胞脂质过氧化水平；将成功转染含APE1基因短发夹RNA序列慢病毒的DC分为敲减APE1+磷酸盐缓冲液（PBS）组、敲减APE1+LPS组，将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组，给予PBS或LPS刺激并培养24 h后同前行相应检测；将成功转染含APE1基因过表达RNA序列慢病毒的DC分为过表达APE1+PBS组、过表达APE1+LPS组，将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组，给予PBS或LPS刺激并培养24 h后同前行相应检测。将88只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为玉米油+假伤组、玉米油+盲肠结扎穿孔（CLP）组、抑制剂+假伤组、抑制剂+CLP组，每组22只。对2个抑制剂组小鼠按照40 mg/kg每日灌胃1 mg/mL APE1抑制剂E3330，对2个玉米油组小鼠每日灌胃等量玉米油，2周后对2个CLP组小鼠行CLP术构建脓毒症模型，对2个假伤组小鼠行假手术。从4组小鼠中各选取16只，观察术后7 d内存活情况；术后24 h采用CD11c阳选磁珠提取4组分别剩余的6只小鼠脾脏DC同前行相应检测（样本数为3）。
结果 与LPS处理0 h比较，LPS处理6 h时细胞中APE1蛋白表达显著升高（P<0.05），LPS处理24、48、72 h时细胞中APE1与GPX4蛋白表达及LPS处理24 h时细胞中SLC7A11蛋白表达均显著降低（P<0.05），LPS处理24、48、72 h时细胞中活性氧水平（P<0.05）与细胞脂质过氧化水平均显著升高。培养24 h后，敲减APE1+LPS组细胞中GPX4蛋白表达较敲减APE1+PBS组显著降低（P<0.05），细胞中活性氧水平（P值均<0.05）及细胞脂质过氧化水平均显著高于敲减APE1+PBS组与空载体+LPS组。培养24 h后，过表达APE1+LPS组细胞中APE1、SLC7A11、GPX4蛋白表达均较空载体+LPS组显著升高（P<0.05），细胞中活性氧水平（P<0.05）及细胞脂质过氧化水平显著低于空载体+LPS组。术后24 h，抑制剂+CLP组小鼠细胞中APE1与GPX4蛋白表达水平均显著低于抑制剂+假伤组、玉米油+CLP组（P<0.05）；玉米油+CLP组小鼠细胞中活性氧水平（12 693±913）显著高于玉米油+假伤组（4 205±805，P<0.05），抑制剂+CLP组小鼠细胞中活性氧水平（18 085±223）显著高于抑制剂+假伤组（4 381±787）和玉米油+CLP组（P值均<0.05）；抑制剂+CLP组小鼠细胞脂质过氧化水平显著高于抑制剂+假伤组与玉米油+CLP组。术后7 d内，抑制剂+CLP组小鼠存活比显著低于抑制剂+假伤组（χ2=22.67，P<0.05）。
结论 模拟脓毒症状态下，小鼠DC中APE1表达降低，氧化应激及铁死亡增强；敲减APE1后加重DC铁死亡，过表达APE1可有效减轻DC铁死亡；抑制DC中APE1表达与脓毒症预后不良密切相关。
关键词：脓毒症；树突细胞；氧化性应激；铁死亡；脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1
脓毒症是机体对严重感染反应失调所引起的器官功能障碍，具有极高的发病率及致死率［1-4］。研究显示，脓毒症发生发展病程中常伴发免疫失衡，即早期的全身性过度炎症反应及晚期的持续性免疫抑制，这是导致脓毒症患者死亡的关键因素［5-7］。树突状细胞（dendritic cell，DC）因其专职抗原提呈功能和通过细胞因子等方式对多种免疫细胞发挥调控效应，在病原体入侵时免疫反应启动与调节中具有重要作用［8-9］。业已证明，DC在脓毒症发生发展过程中呈现显著功能障碍、数量减少及亚群比例改变［10-11］，而其调节性细胞死亡是脓毒症免疫抑制的重要原因之一［12-15］。铁死亡是近年来新发现的调节性细胞死亡方式，其本质是铁超载诱导氧化应激造成的脂质过氧化［16-17］。研究表明，脓毒症状态下DC可发生铁死亡［18］。脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1（apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease 1，APE1）系具有DNA修复活性和氧化还原调节功能的核酸内切酶［19］。当细胞发生氧化应激时，活性氧可直接诱导APE1表达上调以促进相关细胞因子表达且同时抑制细胞内活性氧积累，从而保护细胞使其免受氧化应激诱导的DNA损伤和细胞死亡［20］。本研究旨在探讨APE1对模拟脓毒症状态下DC铁死亡的作用，为改善创面感染等引起的脓毒症免疫抑制提供依据。本实验研究进行动物实验前已通过解放军总医院医学伦理委员会审批，实验过程符合国家及单位实验动物管理和使用规定。88只6~8周龄体重20~22 g雄性健康无特殊病原体级C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0008。小鼠DC系DC2.4购自湖南丰晖生物科技有限公司。含APE1基因短发夹RNA序列的慢病毒、含APE1基因过表达RNA序列的慢病毒及空载慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。LPS购自美国Sigma公司，兔抗小鼠APE1、溶质载体家族7成员11（solute carrier family member，SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）单克隆抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体、小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体购自美国Proteintech公司，APE1抑制剂E3330购自美国MCE公司，试剂级玉米油购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，小鼠CD11c阳选磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司，小鼠脏器淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光探针购自北京索莱宝科技有限公司，荧光核酸染料Hoechst 33342购自美国Immunochemistry Technologies公司，RPMI-1640培养基、脂质过氧化传感器BODIPY™ 581/591 C11购自美国Thermo Fisher Scientific公司。ImageQuant LAS 4000型化学发光成像分析仪、DeltaVision Ultra型高分辨率活细胞成像系统购自美国GE通用电气公司，CANTO PLUS型流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson公司。将小鼠DC系DC2.4接种于T25培养瓶中，加入6~8 mL含体积分数15%胎牛血清+100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、5 958 mg/L缓冲剂和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基（以下称为完全培养基），于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳细胞培养箱中培养（即常规培养），每1~2天进行换液，待细胞生长达80%融合时按1∶2比例进行传代，取第3~10代对数生长期的细胞进行实验。取DC用完全培养基培养，加入1 μg/mL LPS（浓度下同）处理0（未处理）、6、12、24、48、72 h构建脓毒症模型，收集各时间点细胞进行后续检测，样本数均为3。1.3.2 细胞中APE1及抗铁死亡蛋白的蛋白表达检测裂解各时间点细胞2×106 个，使用蛋白质印迹法检测APE1、GPX4、SLC7A11蛋白表达。一抗分别为兔抗小鼠APE1单克隆抗体（稀释比为1∶10 000）、兔抗小鼠GPX4单克隆抗体（稀释比为1∶5 000）、兔抗小鼠SLC7A11单克隆抗体（稀释比为1∶5 000）和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体（稀释比均为1∶5 000）。以β肌动蛋白为内参照，采用Image J图像分析软件（美国国立卫生研究院）计算目的蛋白与内参照蛋白的灰度值比值，以此表示蛋白表达水平。用无血清RPMI-1640培养基配制含10 μmol/L DCFH-DA的工作液。将各时间点细胞按2×107个/mL悬浮于工作液中，常规培养20 min，用流式细胞仪检测细胞中活性氧水平（以荧光强度表示），用FlowJo软件（美国斯坦福大学）分析荧光强度。收集各时间点细胞2×105 个，加入1 mL脂质过氧化传感器工作液及1 μL Hoechst 33342，常规培养30 min后，加入1 mL无血清RPMI-1640培养基，应用高分辨率活细胞成像系统于126倍放大倍数下观察细胞脂质过氧化水平。未发生过氧化的脂质为红色，发生过氧化的脂质为绿色，合成后绿色荧光越强表示细胞脂质过氧化水平越高。1.4 敲减或过表达APE1基因DC的修饰编辑及LPS刺激DC后铁死亡相关情况检测
参照文献［14］的基因转染方法，分别用含APE1基因短发夹RNA序列慢病毒、含APE1基因过表达RNA序列慢病毒、空载慢病毒转染DC，将DC与慢病毒共培养16 h后，更换新的完全培养基。将成功转染含APE1基因短发夹RNA序列慢病毒的DC分为敲减APE1+PBS组、敲减APE1+LPS组，将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组；将成功转染含APE1基因过表达RNA序列慢病毒的DC分为过表达APE1+PBS组、过表达APE1+LPS组，另将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组。对前述基因敲减和过表达实验中各2个LPS组细胞给予1 μg/mL LPS刺激，各2个PBS组细胞给予等量PBS刺激，培养24 h后收集各组细胞同1.3.2~1.3.4进行相应检测，样本数均为3。1.5 小鼠脓毒症模型制作与存活比分析及脾脏DC分离提取与铁死亡相关情况检测
将88只C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为玉米油+假伤组、玉米油+CLP组、抑制剂+假伤组、抑制剂+CLP组，每组22只。对2个抑制剂组小鼠按照40 mg/kg每日灌胃用玉米油稀释至1 mg/mL的E3330，对2个玉米油组小鼠每日灌胃等量玉米油。2周后参照文献［13］对2个CLP组小鼠行CLP术构建脓毒症模型，对2个假伤组小鼠行假手术。从4组小鼠中各选取16只单笼饲养，观察小鼠术后7 d内的存活情况，采用GraphPad Prism 9.0软件绘制小鼠生存曲线图。术后24 h，取各组分别剩余的6只小鼠，颈椎脱臼处死后取脾脏，参照文献［13］使用CD11c阳选磁珠分离纯化原代脾脏DC，常规离心计数后收集各组细胞同1.3.2~1.3.4进行相应检测，样本数均为3。采用SPSS 27.0统计软件进行数据分析，计量资料数据均符合正态分布，以![]()
表示，单一细胞多个时间点间总体比较、多组间总体比较采用单因素方差分析，时间点间、组间两两比较行LSD检验；计数资料数据采用频数（比）表示，多组间总体比较采用log-rank检验，两两比较采用Mantel-Cox检验。P<0.05表示差异有统计学意义。与LPS处理0 h比较，LPS处理6 h时细胞中APE1蛋白表达显著升高（P<0.05），LPS处理24、48、72 h时细胞中APE1与GPX4蛋白表达及LPS处理24 h时细胞中SLC7A11蛋白表达均显著降低（P<0.05）。见图1与表1。![]()
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LPS处理0、6、12、24、48、72 h时细胞中活性氧水平分别为2 701±250、2 825±30、4 832±409、11 106±1 001、15 975±188、16 804±2 291，总体比较，差异有统计学意义（F=115.60，P<0.001）。与LPS处理0 h比较，LPS处理6、12 h时细胞中活性氧水平无显著变化（P值分别为>0.999、0.197），LPS处理24、48、72 h时细胞中活性氧水平均显著升高（P<0.001）。LPS处理0~12 h时细胞脂质过氧化水平低，LPS处理24~72 h时细胞脂质过氧化水平显著高于LPS处理0~12 h，见图2。![]()
2.2 调控APE1表达后LPS刺激DC对细胞铁死亡相关情况的影响
基因敲减实验中，培养24 h后，空载体+LPS组细胞中APE1、SLC7A11、GPX4蛋白表达与敲减APE1+PBS组细胞中APE1和SLC7A11蛋白表达均较空载体+PBS组显著降低（P<0.05），敲减APE1+LPS组细胞中GPX4蛋白表达较敲减APE1+PBS组显著降低（P<0.05）。基因过表达实验中，培养24 h后，空载体+LPS组细胞中SLC7A11与GPX4蛋白表达均较空载体+PBS组显著降低（P<0.05），过表达APE1+PBS组细胞中APE1蛋白表达较空载体+PBS组显著升高（P<0.05），过表达APE1+LPS组细胞中APE1、SLC7A11、GPX4蛋白表达均较空载体+LPS组显著升高（P<0.05）。见图3与表2、3。![]()
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基因敲减实验中，培养24 h后，空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减APE1+PBS组、敲减APE1+LPS组细胞中活性氧水平分别为4 970±532、9 541±142、7 463±620、19 698±2 231，组间总体比较，差异有统计学意义（F=88.70，P<0.001）。与空载体+PBS组比较，空载体+LPS组细胞中活性氧水平显著升高（P=0.007），敲减APE1+PBS组细胞中活性氧水平无显著变化（P=0.122）；敲减APE1+LPS组细胞中活性氧水平显著高于敲减APE1+PBS组与空载体+LPS组（P值均<0.001）。基因过表达实验中，培养24 h后，空载体+PBS组、空载体+LPS组、过表达APE1+PBS组、过表达APE1+LPS组细胞中活性氧水平分别为3 751±117、9 728±624、976±220、1 421±157，组间总体比较，差异有统计学意义（F=408.40，P<0.001）。与空载体+PBS组比较，空载体+LPS组细胞中活性氧水平显著升高（P<0.001），过表达APE1+PBS组细胞中活性氧水平显著降低（P<0.001）；过表达APE1+LPS组细胞中活性氧水平与过表达APE1+PBS组相近（P=0.442），但显著低于空载体+LPS组（P<0.001）。基因敲减实验中，培养24 h后，空载体+PBS组与敲减APE1+PBS组细胞脂质过氧化水平低，低于空载体+LPS组，显著低于敲减APE1+LPS组。基因过表达实验中，培养24 h后，空载体+PBS组、过表达APE1+PBS组、过表达APE1+LPS组细胞脂质过氧化水平低，显著低于空载体+LPS组。见图4。![]()
2.3 抑制APE1后脓毒症小鼠脾脏DC铁死亡相关情况
术后24 h，玉米油+CLP组小鼠细胞中APE1、SLC7A11与GPX4蛋白表达均显著低于玉米油+假伤组（P<0.05），抑制剂+CLP组小鼠细胞中APE1与GPX4蛋白表达均显著低于抑制剂+假伤组、玉米油+CLP组（P<0.05）。见图5与表4。![]()
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术后24 h，玉米油+假伤组、玉米油+CLP组、抑制剂+假伤组、抑制剂+CLP组小鼠细胞内活性氧水平分别为4 205±805、12 693±913、4 381±787、18 085±223，组间总体比较，差异有统计学意义（F=256.20，P<0.001）。与玉米油+假伤组比较，玉米油+CLP组小鼠细胞中活性氧水平显著升高（P<0.001），抑制剂+假伤组小鼠细胞中活性氧水平无显著变化（P=0.990）；抑制剂+CLP组小鼠细胞中活性氧水平显著高于抑制剂+假伤组及玉米油+CLP组（P值均<0.001）。术后24 h，玉米油+假伤组与抑制剂+假伤组小鼠细胞脂质过氧化水平低，稍低于玉米油+CLP组；抑制剂+CLP组小鼠细胞脂质过氧化水平显著高于其余3组。见图6。![]()
术后7 d内，4组小鼠存活比比较，差异有统计学意义（χ2 =39.56，P=0.023），玉米油+CLP组小鼠存活比显著低于玉米油+假伤组（χ2=12.32，P<0.001），抑制剂+CLP组小鼠存活比显著低于抑制剂+假伤组（χ2=22.67，P<0.001），抑制剂+CLP组与玉米油+CLP组小鼠存活比相近（χ2=3.21，P=0.073）。见图7。![]()
尽管脓毒症发病机制研究有所进展，但免疫功能紊乱仍是脓毒症发生发展过程中亟待解决的难题［21-22］，而以DC为代表的免疫细胞功能障碍及耗竭与脓毒症免疫抑制密切相关［23-24］。研究证实，LPS可诱导小鼠DC发生多种形式的细胞死亡，导致其数量减少及功能失调［13-14］；同时，感染引发炎症因子释放，铁离子通过“营养免疫”机制进入细胞，诱导氧化应激导致铁死亡［25-26］。APE1作为关键抗氧化元件，参与调控多条氧化还原通路，并与铁死亡调节蛋白相互作用［20］。鉴于APE1在细胞维持氧化还原稳态及对抗细胞死亡过程中所发挥的重要作用［27-31］，本研究率先探讨APE1在模拟脓毒症状态下DC铁死亡中的潜在作用及其免疫学效应，旨在为脓毒症治疗提供新思路。本课题组根据前期研究并参考相关文献［13］，选择1 μg/mL为LPS刺激浓度，刺激后DC中抗铁死亡蛋白GPX4、SLC7A11的蛋白表达于24 h显著降低，活性氧水平则升高，细胞于刺激24 h后呈现显著脂质过氧化现象，有理由推测LPS刺激后DC发生了铁死亡。既往研究表明，APE1在多种肿瘤细胞中表达上调，在一定程度上抑制脂质过氧化产物积累，保护细胞使其免受铁死亡损伤［20，32］。另有观点认为APE1上调是由活性氧引发的代偿机制，以防止活性氧对DNA及其他细胞结构的破坏［33-34］。与上述结果一致，本研究中LPS刺激DC早期，细胞中APE1表达与活性氧水平同步升高。值得注意的是，LPS刺激DC 24 h后APE1表达显著降低，而活性氧水平与细胞脂质过氧化水平显著升高，提示DC铁死亡与APE1表达变化相关。为了验证设想，选择24 h作为后续研究的刺激时间点，分析调节APE1表达水平后用LPS刺激24 h对DC铁死亡的影响。采用慢病毒转染技术，用含APE1基因短发夹RNA序列慢病毒敲减DC中APE1表达，观察到相较于空载体+PBS组、空载体+LPS组，敲减APE1+PBS组、敲减APE1+LPS组细胞APE1蛋白表达降低。进一步分析显示，APE1基因抑制加剧了LPS刺激下DC铁死亡，表现为抗铁死亡蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表达降低，活性氧水平与脂质过氧化水平升高。同时，本课题组使用含APE1基因过表达RNA序列慢病毒再次进行实验，观察到过表达APE1+PBS组、过表达APE1+LPS组DC中APE1蛋白表达显著高于空载体+PBS组、空载体+LPS组，且APE1的过表达抑制了LPS刺激下DC的铁死亡现象。以上结果显示，APE1在LPS诱导DC铁死亡过程中具有潜在保护效应。为进一步证明APE1在脓毒症发生发展过程中的保护作用，本团队使用CLP术构建小鼠脓毒症模型，依据参考文献［35］的实验方法给予APE1特异性抑制剂E3330进行体内验证。结果证实，E3330处理后脓毒症小鼠脾脏DC中APE1、GPX4蛋白表达降低，活性氧水平与脂质过氧化水平升高，与前述细胞实验结果相符。术后7 d内存活比分析显示，APE1蛋白对CLP术后小鼠具有保护作用，抑制其表达将增加小鼠病死率。需要说明的是，本实验存在一定局限性，尚未深入探究APE1调控铁死亡的信号机制，且脓毒症状态下DC中APE1表达水平降低的确切原因及其对DC免疫功能的影响亟待阐明。本研究仅为阶段性工作，后续本课题组将进一步探索该过程的具体分子机制以及脓毒症状态下APE1表达改变对DC功能的影响，以期探明APE1作为脓毒症免疫抑制潜在治疗靶点的可能性。本研究结果表明，模拟脓毒症状态下，小鼠DC中APE1表达降低，氧化应激及铁死亡增强；敲减APE1后DC铁死亡加重，过表达APE1可有效减轻DC铁死亡；抑制DC中APE1表达与脓毒症预后不良密切相关。进一步了解AEP1对脓毒症DC的影响及其机制可为探索脓毒症干预策略提供新线索。作者贡献声明
周岐原：实验操作、论文撰写；李京宴：实验设计、论文修改；姚咏明、田英平：研究指导、论文修改和经费支持参考文献略
引用本文: 段昱,姚人骐,郑丽玉,等.序列相似性家族134成员B介导的内质网自噬对内毒素/脂多糖诱导的小鼠树突状细胞凋亡的影响[J].中华烧伤与创面修复杂志,2023,39(9):857-866.DOI:10.3760/cma.j.cn501225-20230227-00063.
引用本文: 孙炳伟,王逸凡,杨云稀.中性粒细胞与烧伤脓毒症[J].中华烧伤与创面修复杂志,2024,40(7):618-624.DOI:10.3760/cma.j.cn501225-20240329-00109.
引用本文: 姚咏明,张卉,吴瑶.靶向树突状细胞的脓毒症免疫调理新策略[J].中华烧伤与创面修复杂志,2023,39(7):606-611.DOI:10.3760/cma.j.cn501225-20230321-00087.
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