![]()
摘要：用作疫苗抗原的蛋白质的糖基化可以影响疫苗的安全性和有效性，因此可以是产品质量的一个属性。糖基化是指一组翻译后修饰，其中寡糖与蛋白质内的氨基酸残基相连。在治疗性糖蛋白中，这些翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性、指导蛋白质折叠、调节药物血清半衰期，并影响糖蛋白结合的伴侣。蛋白质结构中聚糖的成分和位置也可以影响其功能，以及向细胞亚室和特定组织的转运。
1 引言
在宿主-病原体相互作用方面，糖基化可以在一系列过程中发挥重要作用，包括但不限于抗原掩盖、与免疫系统凝集素相互作用[1]，以及作为抗原位点的组成部分[2]。此外，作为病原体的一部分，蛋白质抗原的糖基化状态具有动态性。随着病原体的不断进化，糖基化位点可能会通过突变而改变位置，数量也会发生变化，同时糖链的组成和精细结构也可能发生改变。对于抗原，如快速进化的病毒抗原，可以通过在蛋白质序列中识别N-糖基化识别序列（sequon）和分析完整蛋白质（例如，通过凝胶电泳）来监测其肽序列的N-糖基化状态。更全面的分析可能会提高疫苗的质量和效率。本文将讨论疫苗抗原的糖基化，包括其生物学意义、监测可能改善疫苗性能的实例、相关的分析方法，以及行业在糖基化分析方面的现有资源和指导。2 N-和O-糖基化：简要概述
真核蛋白质（包括蛋白质抗原）上存在两种主要的糖基化类型，即N-糖基化和O-糖基化[3,4]。糖基化最常发生在蛋白质的天冬酰胺残基（N-糖基化）和丝氨酸/苏氨酸残基（O-糖基化）上，这两种残基均可见于包膜病毒的刺突蛋白中[5]。图1和图2分别展示了代表性的N-糖链和O-糖链。对于N-糖链，图1中所示的经典Man9GlcNAc2高甘露糖糖链是所有其他N-糖链的衍生来源。前体Glc3Man9GlcNAc2被转移到新生蛋白质中具有通用肽序列AsnX-Ser/Thr（其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸）的位点。随后，Glc残基被修剪，留下Man9GlcNAc2。图1.来自哺乳动物、昆虫和植物细胞系的代表性N-糖链。在三种物种中，经典的Man9GlcNAc2是所有N-糖链的前体。Man3GlcNAc2是三种物种中常见的核心五糖结构，它出现在内质网和高尔基体甘露糖苷酶作用之后。在哺乳动物中，由此产生的糖链可以是高甘露糖型（顶部）、杂合型（中部）或复杂型糖链（底部）。杂合型糖链可以保留一部分经典Man9GlcNAc2原有的甘露糖残基。昆虫N-糖链中可能包含最多两个与还原端GlcNAc相连的Fuc残基。植物N-糖链可能在被平分的核心Man残基处被Xyl取代。此处使用了糖链的符号命名法[62]。图2. 来自哺乳动物和昆虫细胞系的代表性O-糖链：哺乳动物的核心结构1至4显示于左侧（从上至下）。唾液酸作为负电荷基团。昆虫O-糖链显示于右侧。昆虫细胞不产生唾液酸O-糖链，而是产生含有葡糖醛酸（GlcA）的糖链，葡糖醛酸作为负电荷基团。其中一些还可能含有两性离子取代基，如磷酸胆碱和磷酸乙醇胺，这些取代基具有免疫调节作用。糖链的表示方式从左至右为非还原端（离蛋白质最远）到还原端（糖链与蛋白质连接的点）。此处使用了糖链的符号命名法[62]。在哺乳动物和植物系统中，为了生成复杂型和杂合型糖链，Man9GlcNAc2中的甘露糖（Man）残基会被移除，从而生成Man5GlcNAc2。随着GlcNAc、Gal和唾液酸等单糖的加入，甘露糖的进一步修剪可能同时发生，形成如图1所示的代表性结构。图1中还展示了Man3GlcNAc2，它是所有高等真核生物N-糖链的共同核心。在植物中，紧邻GlcNAc2核心残基的甘露糖核心残基可以被木糖（Xyl）取代，这与过敏风险相关[6]。昆虫中的N-糖链加工过程与高等真核生物存在显著差异，产生的糖链较短，且大多数扩展较少[7]。高甘露糖糖链是昆虫细胞中N-糖链的重要组成部分。最常见的形式是短链寡甘露糖，含有四个或更少的甘露糖残基（见图1中的代表性结构）。核心中可能包含多达两个岩藻糖（Fuc）残基，并且某些排列方式可能呈现过敏风险。虽然可以发生一些带有额外单糖的次要扩展，但通常仅限于添加一个或两个残基，从而形成简化的类似哺乳动物的复杂型和杂合型N-糖链。真核细胞的O-糖基化发生在特定的丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）残基上。虽然没有单一的共识序列，但O-糖基化往往发生在含有连续丝氨酸/苏氨酸且其间隔有脯氨酸（Pro）残基的区域。哺乳动物和昆虫细胞系的代表性O-糖链如图2所示。Core-1样结构在高等真核生物中很常见，但其延伸部分可能复杂且呈分支状。昆虫O-糖链与哺乳动物形式不同。一些昆虫O-糖链对人类来说是完全陌生的，因此可能与过敏风险相关。昆虫细胞中不太常见的形式可能包含两性离子取代基，如磷酸胆碱和磷酸乙醇胺，这些取代基可能具有免疫调节作用[8]。植物不形成类似的O-糖链，而是形成木聚糖并对羟基赖氨酸进行糖基化。这些对人类来说都是陌生的，并存在过敏风险。植物不形成与动物形式相似的O-糖链。它们不是主要对丝氨酸/苏氨酸进行O-糖基化，而是对丝氨酸、羟基赖氨酸（HyL）和羟基脯氨酸（HyP）进行糖基化。与哺乳动物系统不同，它们很少以N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）为起始，而是以木糖（Xyl）和半乳糖（Gal）为起始来形成O-糖链[9]。3 不同细胞基质的糖基化差异
针对病毒抗原的疫苗已在受精鸡胚中生产，但也在MDCK、VERO、MRC5、HEK293、CHO、Sf9和HIGH5等细胞系中生产，其中后两种为昆虫来源。所有这些细胞系都已被用于生产美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗。疫苗生产中使用的细胞基质已有相关综述[10]。这些统称为细胞基质。糖蛋白抗原可作为亚单位抗原生产，作为天然或分子修饰病毒的组成部分，或作为病毒颗粒的组成部分。已有多种在植物或植物细胞系中生成的实验性疫苗。例如，烟草植物细胞系已被用于生产疫苗病毒样颗粒[11]以及亚单位疫苗[12]。所有这些细胞基质都具有固有的糖基化特性。在疫苗设计中，目标通常是紧密模拟抗原的天然形式，包括其糖基化模式，因为这些可能是抗原位点的一部分，或以其他方式调节免疫反应。如图1和图2所示，来自哺乳动物、昆虫和植物细胞基质的糖链在组成和结构细节（如连接方式和分支构型）上存在差异，这可能影响功能。任何对宿主来说陌生的N-或O-糖链都可能产生过敏风险[13,14]。与哺乳动物和鸟类相比，昆虫O-糖链的结构定义较少。此外，HIGH5和Sf9细胞已被证明比哺乳动物或卵细胞基质更频繁地对一些低效序列进行糖基化。HIGH5、Sf9和一种哺乳动物化的sf9细胞系SfSwt-7均对流感H5N1血凝素（HA）中的Asn 209进行了糖基化。以Asn209为中心的序列含有脯氨酸，这在哺乳动物和其他高等真核系统中会阻止N-糖基化。在哺乳动物或鸡卵来源的HA中未观察到这种修饰[15]。这种情况表明，抗原位点可能因细胞基质的不同而差异性地修饰，因此如果糖基化事件发生在这样的区域，抗原结构就会发生变化。4 疫苗糖蛋白抗原
疫苗糖蛋白抗原的一些例子包括HIV GP 120、冠状病毒SARS-CoV-2的刺突蛋白、流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶、乙型肝炎病毒的HBs Ag、埃博拉病毒的包膜糖蛋白以及寨卡病毒的包膜蛋白和非结构蛋白。病毒糖基化的整体性方面已有综述[16]。大多数糖基化位点为N-糖苷型，尽管有些也含有O-糖苷。例如，SARS-CoV-2的刺突蛋白在抗原位点附近以及与功能相关的关键区域（如发生构象变化所需的区域以及与ACE II受体相互作用的区域）含有O-糖基化位点[17]。与治疗性蛋白相比，疫苗抗原在功能上有所不同，其主要目的是产生免疫反应。随着目标病原体在人群中传播，其糖蛋白抗原的糖基化模式在组成、位点数量以及（通过突变）位置方面往往发生变化，导致结构特征发生改变。因此，再加上肽序列的变化，疫苗抗原必须定期更新，以紧密匹配流行的目标病原体。5 糖基化：在疫苗中的功能
糖基化在疫苗抗原性能中发挥着多种至关重要的作用，具体包括： 抗原遮蔽（糖基化可以部分掩盖抗原，使其不易被免疫系统识别，这在某些情况下有助于病毒逃避免疫应答）；
成为抗原位点的关键组成部分（糖链可以构成抗原位点的关键部分，这些位点对于抗体与抗原的结合至关重要）；
作为免疫系统凝集素的目标（糖基化结构还可以作为免疫系统中凝集素（一种能与糖类结构结合的蛋白质）的识别目标，参与免疫应答的调节）。
例如，流感病毒可以通过从禽类或猪类等动物源向人类的动物源性传播（即跨种传播）进入人类群体。通常，在此类事件初期时，流感的主要抗原蛋白——血凝素（HA）的球形头部上糖链很少，而这里却是大多数免疫优势抗原位点所在的位置。（编者：这意味着在感染初期，病毒可能更容易逃避免疫系统的识别，但随着感染的进展，病毒可能会进一步糖基化，从而改变其抗原性和免疫应答的产生。）首先，在跨种传播后，随着流感季节的更迭，病毒倾向于在关键抗原区域获得糖基化位点，这些位点会遮蔽抗原位点，从而改变其化学特征[18]。已有研究表明，此类变化会改变免疫优势和中和抗体应答，使其不再针对这些抗原位点[19]。其次，虽然糖链可能会遮蔽抗原位点，但它们也可以作为抗原位点的重要组成部分。在研究用于季节性疫苗的2016-2017年H3N2流感病毒（分别来源于MDCK细胞、Sf9细胞和鸡胚）时，Zost等人发现，由于第160位氨基酸残基的苏氨酸突变为赖氨酸，鸡胚来源的疫苗中的血凝素（HA）在抗原位点B内失去了一个糖基化位点[20]。鸡胚来源的疫苗效力较低，在年轻人群中这一现象更为明显，因为这一人群先前接触并产生针对该区域抗体的机会较少。与MDCK细胞和其他细胞基质相比，这种适应性突变在鸡胚来源的疫苗中更为常见[21]。这一例子强调了不同细胞基质之间的差异以及监测糖基化的必要性。图3.左侧：头部缺乏糖基化的野生型病毒。右侧：高度糖基化的形式，其中糖基化遮蔽了潜在的抗原位点。左侧展示了球形头部和茎部区域。基于Eggink等人[32]的图1。第三，糖蛋白抗原上特定组成和位置的糖链也可以被宿主先天性免疫因子所靶向。甲型流感H3N2和H1N1毒株的血凝素（HA）在其球形头部区域含有关键的高甘露糖型糖链（见图3）。已有研究表明，这些糖链能与两种关键的先天性免疫系统成分——DC-SIGN[22]和肺表面活性物质SP-D[23,24]相互作用。如果这些高甘露糖型糖基化位点缺失，流感病毒株将具有高度致病性。这些位点对于免疫反应至关重要，前者能引导病原体进入抗原呈递的树突状细胞，后者则参与肺部清除和抗原处理。流感疫苗有多种接种方式，包括肌肉注射和鼻腔给药。考虑到这里概述的某些糖链亚群的功能，了解这些疫苗抗原的糖基化状态可能有助于理解疫苗的性能。由于细胞培养条件和细胞基质的选择可能会改变糖基化模式，因此监测这些关键修饰可能是有必要的。6 从COVID-19中汲取的教训
SARS-CoV-2大流行激发了全球范围内迅速了解这一新型病原体的巨大科学努力。其刺突蛋白（一种经过改造后用作疫苗抗原的蛋白）高度糖基化，检测到有23个N-糖链和最多8个O-糖链，且大多数位点含有多种糖链。为了更深入地了解刺突蛋白的糖基化模式，许多实验室采用了一系列液相色谱/质谱方法，以揭示其精细的结构细节。研究了在HEK293细胞、CHO细胞、sf9昆虫细胞以及SARS-CoV-2病毒颗粒中生产的重组刺突蛋白。据报道，不同细胞基质类型和病毒来源与重组形式的糖基化模式存在显著差异。HEK293细胞来源的重组形式高度糖基化，且比其他哺乳动物细胞基质含有更多的大型多天线N-糖链[17,25,26]。昆虫细胞生产的刺突蛋白如预期般含有较短的N-糖链，检测到的昆虫O-糖链也很短[27]。由于当时昆虫O-糖链数据库的状况，其他更复杂的O-糖链形式可能未被检测到。病毒颗粒中生产的刺突蛋白在特定抗原区域含有较少的复杂糖链和更多的高甘露糖型糖链[26]。Delta毒株的刺突蛋白含有将天冬氨酸614突变为甘氨酸的关键突变，在突变附近的糖基化模式存在差异，这可能是由于局部流动性增加所致。O-糖基化也存在差异，特别是在涉及受体结合[28]和抗原暴露[29]所需的构象变化区域。这表明O-糖基化可能是呈现这种构象的关键。因此，在这种情况下监测O-糖基化可能很重要。7 糖基化在疫苗设计中的作用
糖基化工程已被用作一种免疫聚焦工具，以引导免疫反应远离或针对特定目标区域。这些修饰策略有三个目的：掩盖抗原位点，驱使免疫反应转向抗原性较低的区域；去除糖基化位点，以增强对抗原区域的免疫反应；以及修改抗原区域，以避免病理性免疫反应，如抗体依赖性增强（ADE）[30]。通过添加或去除糖基化位点来改变肽骨架的暴露程度，可以改变区域的抗原性[2]。这种方法已被用于生产流感和其他病毒病原体的更通用疫苗候选物[31]。已生产出高度糖基化的H1N1流感病毒，以此方式驱动免疫反应。为此，在血凝素（HA）的头部区域添加了七个糖基化位点，掩盖了关键的抗原位点Ca1、Ca2、Cb、Sa和Sb[32,33]（头部和茎部区域见图3）。此外，在另一个例子中，从流感HA中去除茎部糖苷，从而暴露出下面的肽骨架，引发了更强大的中和抗体[34]。结果是产生了针对茎部的中和抗体，该区域与头部区域相比通常抗原性不强。在另一个例子中，从HIV GP120 Env三聚体靠近CD4受体结合域的区域删除3或4个糖基化位点，使得B细胞受体更容易接触到受体结合区域[35]。与对照组相比，用这些突变型假病毒免疫的豚鼠针对CD4受体表位的中和抗体滴度显著更高。作者指出，中和滴度的增加与糖苷去除后表位表面积暴露增加相关。糖基化还会影响抗体依赖性增强（ADE）现象，即非中和抗体或中和能力较差的抗体可通过单核细胞中的Fcγ受体促进病毒进入宿主细胞[36]。基本上，病毒利用这些抗体像特洛伊木马一样进入并破坏关键的免疫细胞，从而加剧疾病。这种现象对寨卡病毒、登革热病毒以及该分类群中的相关病原体等黄病毒而言是一个关注点。例如，在寨卡病毒的情况下，Tai等人[37]在一个包含主要表位并倾向于产生与ADE相关的非中和抗体的结构域内的第375位残基处设计了一个糖基化位点。结果是，通过用糖基化和非糖基化版本的病毒免疫小鼠所获得的血清测量，阻止了针对该区域的非中和抗体的产生。目前正在使用此类方法开发避免ADE的疫苗[38]。8 疫苗中糖基化的评估
由于糖基化的模式、组成、位置和结构会影响疫苗的质量，因此需要对糖苷进行彻底的表征。虽然用于监测糖苷的分析方法与其他糖蛋白的基本相同，但为了适应药物物质或药物产品的形式（如基质和赋形剂），可能需要进行一些优化。糖蛋白分析可采用多种技术，而所使用的方法组合的选择将由所需的化学信息决定。这些信息包括N-和/或O-糖基化信息、糖苷组成、精细结构（如异头构型和支链结构）、糖基化位点占据情况和糖基化位点异质性。有决策树可供参考，以指导处理、释放和分析的适当方法，从而获得所需信息[39–41]。应使用参考标准来建立系统适用性，并支持糖苷的准确识别和定量。根据美国药典（USP）通则<1084>糖蛋白和糖苷分析——一般考虑[41]，糖基化分析可分为四个不同层次： 从蛋白质中释放的糖苷；
单糖含量；
完整的蛋白质以及；
通过酶解产生的糖肽；
可以通过多种分析方法对释放的糖苷进行深入研究，以揭示其单糖组成、异头构型、支链结构以及每种糖苷的丰度[42–44]。对完整糖蛋白的分析可以提供关于糖苷总含量和组成的信息。在糖肽水平上进行的分析可以揭示糖基化位点的占据情况、位点异质性和位点组成，同时提供一些精细的结构细节。单糖分析通常用于评估特定糖苷特征（如唾液酸）的存在和数量。N-糖苷可以通过酶法或化学方法释放，并可以以其天然形式或衍生化形式进行分析，主要是作为还原端衍生物或以全甲基化形式存在。还原端衍生物的优势在于可以连接紫外/荧光标签，从而便于进行色谱分析，如美国药典（USP）<212>章“寡糖分析”中所述[45]。虽然全甲基化形式在揭示连接和支链结构方面更为优越，但缺乏紫外/荧光标签。糖苷的丰度和组成可以通过高效液相色谱（HPLC）方法确定，包括但不限于亲水相互作用色谱、高pH阴离子交换色谱、反相色谱、多孔石墨化碳色谱和其他色谱柱基质。毛细管电泳方法也被采用。所有这些方法都已与质谱仪检测器联用，从而为这些分析提供了质量和一些结构信息。有关这些技术和方法的更多信息，请参阅[45–48]。用于释放N-糖苷的分离方法也可以适用于O-糖苷的分析。与N-糖苷不同，O-糖苷的释放方法通常是通过化学方法（如β-消除）进行的[49]。一些化学方法允许将紫外/荧光还原端标签整合到O-糖苷中，从而便于在色谱方法中进行检测[50]。O-糖苷也适用于全甲基化程序。对于单糖分析，通常使用HPLC和气相色谱/质谱方法，如美国药典（USP）<210>章“单糖分析”中所述[51]。对完整糖蛋白的分析通常仅限于那些具有少量翻译后修饰（PTM）的糖蛋白。此类分析中使用基于高分辨率质谱的方法，但随着PTM数量的增加，谱图的解释变得更加困难。然而，生物信息学方法正在不断改进，并且高分辨率仪器应随时间推移而扩展完整蛋白质分析的能力。糖肽分析通常能提供高度有用的信息，因为它能够分析单个糖基化位点上的糖苷丰度和组成异质性。标准方法采用高分辨率质谱与高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳相结合的技术[52–55]。然而，通常无法确定诸如异头构型（α或β）和特定非对映异构体信息（即甘露糖、半乳糖、葡萄糖）等精细结构细节。通常可以根据对细胞基质的了解来推断分支结构和每种单糖组分的特定身份，但在使用此类解释策略时必须谨慎。关于分支位置，可能发生分子内迁移，从而混淆准确的归属[56]。还有一系列可用的碎裂方式，可以根据它们在糖肽归属光谱信息内容方面的优势进行选择[52]。已经开发了一系列信息学软件来辅助游离糖苷和糖肽的解释和归属[57]。新的分析方法，如多属性方法（MAM），利用质谱的特异性来在一次测定中监测包括N-糖基化和O-糖基化在内的多个属性[58–60]。美国药典（USP）<1060>章“基于质谱的治疗蛋白多属性方法”为这些方法提供了指导[61]。MAM方法旨在同时监测多个产品质量属性。从蛋白质被消化成肽，并通过质谱分析肽以识别和定量产品质量属性的意义上讲，这种方法与糖肽分析相似。然而，它也可以应用于许多其他翻译后修饰（PTM），如氧化、脱酰胺、糖基化、截断、片段化或剪切，以及N-端和C-端修饰。MAM通常包括一个表征阶段，用于识别影响产品质量的具体属性，以及一个监测阶段，该阶段使用自动化工作流程来监测已定义的产品质量属性。迄今为止，虽然微阵列毛细管电泳（MAM）主要应用于单克隆抗体，但此类方法也正被用于其他治疗性蛋白质。正如流感和COVID-19所观察到的那样，由于病原体中蛋白质序列的突变和进化压力，其糖基化模式会随时间发生变化，因此需要更新疫苗抗原以应对新变异株。疫苗抗原的糖基化在很大程度上受到生产过程中所用细胞系的影响，这可能导致糖基化位点占有率、聚糖组成、糖基化位点水平的异质性以及其他结构特性的差异。疫苗中的聚糖模式也经常经过工程化改造，以调节抗原性或降低不良事件（如抗体依赖性增强作用，ADE）的潜在风险。因此，通常需要彻底了解和分析疫苗抗原的糖基化，以确保产品的安全性和有效性。虽然有多种方法可用于分析糖基化，但传统方法依赖于从蛋白质骨架中释放聚糖，这有助于识别、定量，并确定聚糖在蛋白质序列中的位置。而更现代的方法，如高分辨率质谱和MAM，可以提供有关聚糖位置的更详细信息，以及结构细节，从而为疫苗设计提供更全面的信息，并支持疫苗质量、安全性和有效性的持续稳定。9 编者按
该篇文章综述了糖基化在疫苗设计中发挥的关键作用，糖基化的形式、糖苷组成、糖基化的位点以及各种糖基化的分析检测方法开发都成为现在疫苗设计研发中的重点。DOI: 10.18609/vac.2023.013文章来源：Medicine Scientific Research
![]()
