HA1-IgY-Fc融合蛋白的重组乳酸乳球菌疫苗接种可在鸡中提供针对H9N2禽流感病毒的保护性粘膜免疫

健康 2024-11-18 15:55 湖北

大家好，今天给大家分享的是来自河北北方学院张瑞华教授团队在“Virology Journal”上发表的一篇名为“Vaccination with recombinant Lactococcus lactis expressing HA1-IgY Fc fusion protein provides protective mucosal immunity against H9N2 avian influenza virus in chickens”的文章，在这项研究中，作者构建了一种新的乳酸乳球菌（L. lactis）菌株，表达由H9N2地方性病毒株的HA1蛋白和鸡IgY Fc片段组成的重组融合蛋白，评价了重组乳酸乳杆菌HA1-Fc菌株的免疫原性和保护作用。

研究背景

H9N2病毒主要通过呼吸道粘膜途径传播，因此粘膜免疫被认为在控制禽流感感染中发挥了很好的作用。人们普遍认为，灭活疫苗不能产生足够的黏膜免疫，而灭活疫苗被广泛用于预防和控制禽流感病毒感染。因此，迫切需要一种既能诱导粘膜免疫又能诱导全身免疫的改良疫苗来控制家禽养殖场的H9N2禽流感疫情。

研究结果

重组蛋白的鉴定

将HA1-Fc基因克隆到表达载体pMG36e中并通过测序进行验证，通过电穿孔法将重组质粒pMG36e-HA1-Fc转化到乳杆菌MG1363中。通过Western blot观察到阳性重组乳杆菌HA1-Fc表达了74 kDa的蛋白条带。结果证实了重组HA1-Fc融合蛋白的表达以及对禽流感A型血凝素抗体的良好反应原性（图1）。

图1：乳酸菌HA1-Fc蛋白的Western blot分析

乳酸乳杆菌HA1‑Fc诱导的HI抗体水平

采用重组乳酸乳杆菌HA1-Fc作为口服疫苗对SPF鸡进行免疫。然后测量HI抗体水平，以确定乳酸乳杆菌HA1-Fc是否能刺激机体产生特异性抗体。结果表明，乳酸菌HA1-Fc口服免疫鸡的HI抗体水平明显高于乳酸菌或PBS口服免疫鸡（P<0.01）。乳酸菌HA1-Fc口免疫鸡的HI抗体水平显著高于乳酸菌HA1口免疫鸡（P<0.01）。作者的数据还显示，虽然接种灭活疫苗可诱导高HI抗体，但在接种灭活疫苗和乳杆菌HA1-Fc的鸡中未检测到HI抗体的显著差异（图2A）。这一结果证明重组乳酸乳杆菌HA1-Fc能够刺激机体产生特异性抗体和Fc片段在产生特异性抗体中起重要作用（图2A）。

图2：乳酸乳杆菌HA1-Fc诱导的HI抗体水平及特异性IgG水平

乳酸乳杆菌HA1‑Fc增强特异性IgG水平

为研究口服乳杆菌HA1-Fc疫苗接种鸡后血清中IgG的特异性水平，采用间接ELISA法检测各组鸡的血清样本。如图2B所示，与L. lactis HA1-Fc组经口服免疫后特异性IgG水平明显高于PBS组（P<0.001）。值得注意的是，与乳杆菌HA1组相比，口服乳杆菌HA1- Fc接种鸡血清中特异性IgG滴度明显升高（P<0.01）。在HI抗体水平上，乳酸菌HA1-Fc组与灭活疫苗组特异性IgG滴度无显著差异（P<0.01）。因此，作者的数据可以推断乳杆菌HA1-Fc能够在鸡体内刺激强烈的体液免疫反应。

图2：乳酸乳杆菌HA1-Fc诱导的HI抗体水平及特异性IgG水平

疫苗接种后粪便和支气管肺泡灌洗液中的SIgA抗体水平

为评价重组乳杆菌HA1-Fc是否能诱导机体黏膜免疫，作者在每次免疫后检测各组鸡的sIgA抗体（图3）。结果显示，乳杆菌HA1-Fc接种组肠道sIgA水平明显高于PBS接种组和乳杆菌接种组（P<0.01）；乳杆菌HA1-Fc免疫鸡的sIgA抗体滴度高于乳杆菌HA1免疫鸡（P<0.01）（图3A）。此外，乳酸菌HA1-Fc接种组sIgA水平也显著高于灭活疫苗组 (P<0.01) (图3)。

支气管中的SIgA水平与肠道中的SIgA水平趋势相似（图3B）。乳酸菌HA1- Fc疫苗组SIgA水平极显著高于PBS疫苗组和乳酸菌疫苗组（P<0.01），且乳酸菌HA1- Fc免疫组的SIgA抗体滴度高于乳酸菌HA1和灭活疫苗免疫组（P<0.01）。此外，乳杆菌免疫组和PBS免疫组的鸡在免疫后的粪便和支气管肺泡灌洗液样品中诱导的sIgA抗体也有统计学差异。因此，乳酸乳球菌可以改善粘膜免疫机制，是蛋白质递送的良好载体。重组乳杆菌HA1-Fc可诱导粘膜反应增强。

图3：乳酸乳杆菌HA1-Fc诱导的黏膜抗体水平

重组乳杆菌HA1‑Fc诱导的肠黏膜细胞因子

本研究收集了所有鸡的肠道组织，采用实时荧光定量PCR检测了黏膜细胞因子水平。如图4所示，乳杆菌HA1- Fc接种组IL-2、IFN-γ和IL-4（分别作为Th1和Th2的标记物）水平显著高于乳杆菌接种组和PBS接种组，且乳杆菌HA1-Fc接种组这三种细胞因子水平均显著高于乳杆菌HA1接种组（P<0.01）。灭活疫苗组的IL-2、IL-4和IFN-γ细胞因子水平均高于灭活疫苗组（P<0.05），但乳杆菌HA1-Fc免疫组的IL-2、IL-4和IFN-γ水平高于灭活疫苗组（P<0.05）。此外，在统计学上乳酸菌与PBS免疫组鸡免疫后诱导的粘膜细胞因子水平差异显著（图4）。因此，结果表明乳酸菌HA1-Fc片段显著促进了鸡细胞因子的分泌。乳酸乳球菌可以激活免疫细胞，提高免疫反应。经乳杆菌HA1-Fc免疫的鸡体内IL-2和IFN-γ水平均高于IL-4水平，表明鸡的Th1型免疫应答大于Th2型免疫应答。

图4：乳杆菌HA1-Fc诱导肠组织中IL-2、IL-4和IFN-γ水平

T细胞增殖实验

采用Cell Proliferation ELISA BrdU Kit检测细胞免疫应答。

结果显示，接种乳酸菌HA1、乳酸菌HA1- Fc或灭活疫苗组的鸡在合成HA1肽刺激下，T细胞对HA1肽的增殖反应增强，而接种PHA或RPMI的鸡对HA1肽无反应（图5）。乳酸菌HA1- Fc组的刺激指数显著高于乳酸菌组和PBS组。乳酸菌HA1- Fc组首次免疫和强化免疫后的刺激指数显著高于乳酸菌HA1组（P<0.05）。灭活疫苗组的刺激指数较高，但乳杆菌HA1-Fc免疫组的刺激指数高于灭活疫苗组（P<0.05）。上述结果提示乳杆菌HA1-Fc可显著促进鸡的免疫应答。

图5：T细胞增殖实验

乳酸菌HA1‑Fc对H9N2亚型AIV的保护作用

为了评价重组乳酸乳杆菌HA1-Fc菌株对H9N2亚型AIV的保护作用，攻毒实验结束后，统计分析各组体征、体重、保护率、病毒脱落、肺部病理变化及肺组织病毒滴度。从病毒攻毒后第3天开始，所有攻毒鸡、PBS和乳酸菌接种鸡均表现出明显的临床症状。感染H9N2病毒后乳酸菌组和PBS组的体重均呈下降趋势，且均明显低于其他3组（P<0.01）（图6）。乳酸菌HA1-Fc组的体重下降幅度小于乳酸菌HA1组，但两组之间的体重变化无统计学意义。乳酸菌HA1-Fc组与灭活疫苗组间差异无统计学意义（P < 0.05）。就病毒脱落周期而言，接种乳杆菌HA1-Fc的鸡病毒复制周期较短（图7）。

图6 ：H9N2禽流感病毒攻毒后接种鸡体重变化

图7：攻毒鸡收集的泄殖腔拭子中检测病毒滴度

组织病理评价

为了进一步评价乳杆菌HA1-Fc的保护作用，作者对各组鸡的病理变化进行了评价。如图8A-E所示，PBS组和乳酸乳杆菌组的鸡出现了明显的病理变化，包括血、淋巴细胞增多；充血;肺腔塌陷，肺上皮细胞脱落。

而乳酸菌HA1-Fc组和灭活疫苗组只有轻微的病理改变。此外，重组乳杆菌 HA1- Fc组显著低于重组乳杆菌 HA1组。结果证实，口服乳酸菌HA1-Fc可通过减少肺部病理变化而对H9N2 AIV病毒产生保护作用。

图8：乳酸乳杆菌HA1-Fc对H9N2流感病毒感染所致肺损伤的保护作用

肺组织病毒滴度测定

为评价重组乳酸乳杆菌HA1-Fc菌株对H9N2亚型AIV的保护作用，检测各组肺组织病毒滴度。结果显示，乳酸乳杆菌HA1-Fc组肺病毒滴度明显低于PBS和乳酸乳杆菌组（图8F）。此外，与乳酸乳杆菌HA组相比，酸乳杆菌HA1-Fc组肺病毒滴度也显著降低（P<0.01）。乳酸菌HA1Fc组与灭活疫苗组病毒滴度无显著差异。

研究结论

文章数据表明，用乳酸乳杆菌HA1-Fc株免疫的鸡，血清抗体水平、黏膜分泌IgA、T细胞介导的免疫反应和淋巴细胞增殖水平显著增加。

此外，在H9N2禽流感病毒攻毒后，经乳杆菌HA1-Fc株免疫的鸡体重减轻，临床症状减轻，病毒滴度降低，肺部病理损伤减轻。经乳杆菌HA1-Fc免疫的鸡感染H9N2流感病毒后，经口咽和生殖道检测到H9N2流感病毒的脱落，结果表明，感染后7 d滴度较低且迅速下降至检测不到的水平。数据显示重组乳酸乳杆菌HA1-Fc菌株可诱导保护性粘膜和全身免疫，本研究为提高免疫应答以预防和控制H9N2病毒感染提供了理论依据。

心得体会

目前，灭活疫苗不能提供预期的保护效果；可能的原因是粘膜免疫和细胞免疫低下。口服疫苗可诱导粘膜免疫和全身免疫，有望成为预防和控制H9N2禽流感感染的有效途径。

乳杆菌被广泛用于治疗性蛋白的粘膜递送。因此乳杆菌载体表达的重组蛋白可诱导粘膜和全身免疫，对攻毒动物具有良好的保护作用。作为一种安全的口服活疫苗载体，乳酸菌具有良好的免疫效果，具有潜在的应用前景。

在本研究中，作者利用L. lactis MG1363表达了含有鸡IgY Fc和H9N2 AIV HA1的融合蛋白。然后评估了这种重组乳酸乳杆菌菌株的免疫原性。本研究还评价了重组乳酸乳杆菌对H9N2亚型AIV口服免疫的保护作用，旨在探索一种预防和控制H9N2亚型AIV的补充方法。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37085816/

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