面向微生物的CRISPR基因编辑工具的功能应用

学术 2024-10-24 14:09 北京

摘要

成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)系统作为一种强大且可调控的基因编辑工具，由于其精准性和灵活性，在微生物机制解析、功能强化以及检测溯源等领域中有着广阔的应用前景。其中，Cas(CRISPR associated)蛋白的特异性识别与切割(cis-cleavage)以及无差别的附属切割(trans-cleavage)，作为CRISPR系统的两大核心功能而备受关注。基于特异性识别和切割功能建立的高效微生物基因组编辑工具，实现了对微生物功能的强化，增强了其在环境保护、生态修复以及能源回收等领域的应用能力；基于其附属切割功能创制的病原微生物的快速检测方法，为病原微生物引起的疫情防控提供了技术支撑。文章着重介绍CRISPR基因编辑技术在微生物中的应用现状和发展前景。

作者｜程洲华，俞汉青

中国科学技术大学环境科学与工程系

1 CRISPR系统概述

在漫长的生命演化历程中，所有生命体为了生存和延续都需要在遗传层面做出响应和调整。微生物作为生命进化历史上的重要分支，在基因突变与修复、防御外源核酸侵害的过程中，进化出一系列富有创造性的基因调控机制。现代的分子生物学工具，大部分源于对微生物操纵核酸过程的研究和模拟，如内切酶特异性识别和切割标志性核酸序列、外切酶顺次水解磷酸二酯键以及聚合酶进行DNA和RNA的高效合成等。

CRISPR-Cas基因编辑技术，源于对微生物体内防御外源核酸入侵的免疫机制的模拟，是基因操作技术的一次革命性突破^[1]。这项技术能够精确地定位并修改核酸序列，从而对生物个体的特性产生显著影响。CRISPR-Cas系统主要由两部分构成：CRISPR阵列和Cas蛋白。CRISPR阵列可以精确识别并定位特定的核酸序列，Cas蛋白则执行切割核酸的功能(图1)^[2-3]。首先，当CRISPR阵列加工后的RNA分子与Cas蛋白形成复合物，便开始搜寻胞内核酸与目标DNA序列配对并绑定，然后由Cas蛋白进行解螺旋和切割，造成DNA的断裂^[4-6]。在细胞修复这一断裂的过程中，科学家可以借此机会进行特定基因的添加、删除或替换^[6-7]。

图1 CRISPR-Cas9系统识别与切割目的核酸的机理^[3]：引导识别的crRNA:tracrRNA经改造成为一条向导RNA(sgRNA)，引导Cas9在细胞体内进行编辑

1.1 CRISPR系统的分类

CRISPR系统的丰富性以及基因组结构的复杂性使得对其进行分类成为一项极具挑战性的任务。在2005年，Daniel Haft等对来自40多种细菌和真菌的CRISPR系统进行分析，发现可以基于Cas1蛋白的系统发育树以及Cas编码基因的操纵子信息将CRISPR-Cas系统分类到8个基因组中^[8-9]。然而，这个初步的分类标准，并未考虑诸多Cas蛋白和Cas操纵子之间的复杂关系以及CRISPR系统的多样性，尤其是对关系较远却存在某种联系的Cas蛋白的命名并不科学。

CRISPR-Cas系统的适应阶段涉及两种重要蛋白，分别为Cas1和Cas2，它们在获取间隔序列(spacer)的过程中发挥关键作用，是该系统的核心组成部分。基于这一认识，Kira Makarova等在2011年对所有包含Cas1和Cas2的CRISPR-Cas系统进行了全新的分类，将其分为三大类型，即类型I～III：包含Cas3蛋白的系统被划为类型I；含有Cas9蛋白的被分类为类型II；而包含Cas10蛋白的被划为类型III^[10]。此外，每个类型又根据特征基因及其排列顺序划分出亚型。这一全新的分类方式体现了以Cas1、Cas2基因为系统核心的思想，使得分类更加系统化，也提供了一个更为有效地理解和研究CRISPR-Cas系统的平台。

然而，随着CRISPR-Cas系统多样性的不断丰富，需要完善和拓展CRISPR-Cas系统的分类方法以适应新的研究需求。在2015年，一项结合系统遗传学、比较基因组学以及结构分析的研究提出了一种综合多学科视角的分类方法，为CRISPR-Cas系统的分类提供新的思路^[11]。该方法重视的是发挥特异性识别与切割(cis-cleavage) 功能的组成模块是否由多亚基复合物组成。因此，根据这种新的分类方法，CRISPR-Cas系统被划分为“1类”和“2类”。在“1类”系统中，发挥功能的模块由多亚基crRNA效应子复合物构成，而在“2类”系统中，主要由单一蛋白，如Cas12、Cas13和Cas9等执行特异性识别与切割功能。进一步研究表明，“1类”和“2类”可以再细分为5个类型、16个亚型。其中，“1类”包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，“2类”包括Ⅱ和Ⅴ型。随后，在2020年的最新分类中，CRSIPR-Cas系统被分为6个类型，包括33个亚型(图2)。其中仅需单一蛋白即可进行特异性识别与切割的Cas9被划分到“2类Ⅱ型”^[12]。

图2 2020年CRISPR-Cas系统的分类^[12]，分为两类6个类型，其中效应子为多个蛋白是“1类”，为单个蛋白则是“2类”

1.2 CRISPR系统的应用

CRISPR-Cas基因编辑技术在生物科学的诸多领域展现出广阔的应用前景。这些领域包括基础研究、基因治疗、生物技术、药物开发、环境保护以及体外诊断等(图3)^[13]。在众多CRISPR系统中，Cas3、Cas9、Cas12和Cas13等蛋白作为核酸酶，在CRISPR-Cas系统中占据核心地位。这些蛋白在不同的CRISPR系统中执行着不同的功能，具有各自独特的性质，并由此催生了多种不同的基因编辑技术。

图3 CRISPR技术的应用^[13]

以Cas3为核心的1类CRISPR系统在进行基因编辑时所展现的特性为研究者们提供了新的可能性。来源于铜绿假单胞菌的Cas3蛋白在切割DNA后会启动其核酸外切酶活性，对裸露的DNA末端进行水解，从而实现长达数十到上百kb的DNA大片段的删除^[14]。与之相比，2类CRISPR系统中的Cas9、Cas12以及Cas13由于其简洁和易用的特性，被广泛应用于基因编辑中。这些单组分核酸酶仅需要与向导RNA(sgRNA)结合，就能对目标基因进行精准编辑。依赖于这种特异性识别和切割的特性，CRISPR-Cas9技术已经在细菌、古菌和真核生物中实现胞内的基因组编辑，并能在基因组特定位点引入随机突变^{[1, 15-16]}。2015年，Jiang等首先利用Cas9特异性切割的能力体外获取基因组上的大片段，构建超大型的质粒表达元件^[17]。更为有趣的是，当研究人员将Cas9蛋白RuvC结构域的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)以及HNH结构域的第840位组氨酸突变为丙氨酸(H840A)，Cas9蛋白的核酸切割功能被抹除，仅保留特异性识别功能。这种突变后的蛋白被称为dCas9(dead Cas9)^[18]。此基础上发展出了诸如CRISPR干扰(CRISPR interference, CRISPRi)用于基因抑制、CRISPR激活(CRISPR activation, CRISPRa)用于激活基因表达，以及结合重组酶聚合酶扩增 (recombinase polymerase amplification, RPA)反应实现核酸分子快速检测等多样化应用^[18-20]。其中，应用最广、设计最精巧的是碱基编辑技术。碱基编辑技术通过dCas9或Cas9n(仅突变D10A)与脱氨酶的结合，可以实现靶向范围内碱基的修改。

与Cas9类似，Cas12也是一种DNA切割蛋白，但是其相较于Cas9具有诸多鲜明的特点。例如：二者识别的原间隔序列相邻基序(protospacer adjacent motif, PAM)序列不同，Cas12a识别富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列，而Cas9往往识别富含鸟嘌呤(G)的序列；Cas12具有从CRISPR阵列中加工形成crRNA的能力，并且只需要crRNA的引导，即可在远离PAM端形成黏性末端的断裂。这些特点都与Cas9形成明显差异。通过失活Cas12，也可以发展出基于Cas12a的CRISPRi、CRISPRa和碱基编辑技术^[21-23]。此外， Cas12与Cas9最为显著的不同在于其附属切割(trans-cleavage)活性。在2018年，Wang和Doudna分别独立地发现了Cas12的附属切割活性——当实现特异性切割之后对非靶向的单链DNA进行切割^[24-25]。这一特性使得Cas12在某些场合具有优势，如用于核酸检测。当Cas12与其sgRNA靶向并切割双链DNA之后，会触发非特异性的单链DNA切割活性^[24]。这种活性可以用于放大检测信号，从而实现病原体的检测。

在CRISPR系统中，Cas13扮演着独特的角色——它是第一个已知的专门靶向切割RNA的Cas蛋白，这使得Cas13在RNA相关的研究领域具有广泛的应用前景^[26]。一方面，基于Cas13，现在能够在细胞内进行精确的RNA编辑以调控基因表达。使用Cas13靶向入侵宿主的RNA病毒，可以建立高效的抗病毒“靶向药物”，抵御病毒的侵害^[27]。通过将Cas13与脱氨酶结合构建出的RNA碱基编辑器，能够在不改变基因组信息的前提下改变翻译后产物^[26]。另一方面，Cas13也被用于开发新的核酸检测技术。例如，在2017年，Zhang等首次揭示了Cas13的附属切割活性，即Cas13在切割目标RNA之后，会进一步切割周围的非特异性RNA^[20]。他们利用这一特性开发出了一种名为SHERLOCK(Speciﬁc High Sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing，意为特异性高灵敏度酶报告系统)的RNA检测技术。

2 CRISPR驱动的环境微生物基因组编辑

在微生物研究中，CRISPR-Cas系统的应用已经深远地影响了人们对于微小生命形式的理解和利用^[28]。无论是在细菌、真菌还是病毒中，CRISPR-Cas技术都已经成为基因组编辑的重要工具，包括基因的插入、删除和替换以及更为精细的碱基编辑^[29]。此外，CRISPR-Cas系统也被用于微生物中的基因表达调控(图4)^[30]。例如，利用dCas9构建的CRISPRi和CRISPRa系统，可以在胞内精准地激活和抑制基因的表达，为研究微生物的基因网络提供了强有力的工具^[31]。这些多样化的微生物基因编辑形式从根本上改变了现有微生物研究的范式^[8]。

图4 CRISPR-Cas9介导的基因敲除、调控、碱基编辑等过程^[30]

2.1 Cas蛋白特异性切割介导的基因组编辑

基于同源重组的基因工程技术由于较低的重组效率，往往需要引入反筛选系统筛除未发生编辑的菌株^[^32]。在同源重组系统引入具有特异性识别位点的核酸内切酶可以显著提升微生物基因组的编辑效率。CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白可以专一地识别RNA分子上的配对序列，从而精确地定位到目标DNA位点进行切割，相较于传统的I-SceI核酸内切酶，具备更优异的可编程性^[7,33]。例如，Martin等在2012年首次在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功应用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑。他们将带有crRNA-tracrRNA的质粒和Cas9表达质粒转化至大肠杆菌中，通过特异性的crRNA-tracrRNA引导Cas9蛋白精确切割目标基因位点，同时提供同源重组模板DNA参与DNA修复过程，实现了基因的精确编辑。该项研究的成功开启了微生物基因组CRISPR-Cas9编辑的新时代。但是也有人认为Cas蛋白在此过程中的作用并非促进了同源重组的发生，而是起到了最后反筛选的作用^[34-35]。

虽然Cas蛋白具体的作用一直处于争论之中，但是由于CRISPR-Cas系统的高效性，在之后的研究中，CRISPR-Cas9系统仍被广泛应用于各种微生物中，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、链霉菌(Streptomyces)等实现了高效的基因编辑^[36-38]。更有研究显示，不同类型的Cas蛋白，如Cas12a(Cpf1)和Cas13等也在微生物基因组编辑中显示出独特的优势^[20, 39]。此外，近年来，为了提高编辑效率和特异性，研究者还对Cas蛋白进行工程化改造，例如设计出高保真度的Cas9变体，能够进一步降低非特异性切割的发生，提高基因编辑的精度^[40]。

2.2 CRISPRi和CRISPRa技术介导的基因调控

对微生物目标基因的精确调控，可以在不改变基因组信息的情况下实现基因的原位抑制和增强，是研究微生物代谢机制及功能强化等的重要手段。失活Cas9蛋白的核酸酶功能，并由此衍生出的CRISPRi和CRISPRa功能可以实现对基因表达的精准调控。

一方面，CRISPRi系统通过失活Cas蛋白的切割功能，仅保留其靶向功能，从而抑制目标基因的转录。自Doudna等首先将CRISPR-Cas9应用于大肠杆菌用于基因的敲除后^[15]，在2013年，Qi等首先在大肠杆菌和哺乳动物细胞中构建了CRISPRi系统，他们将dCas9蛋白与sgRNA导向至目标基因的启动子区或编码区，阻止RNA聚合酶的结合，进而影响转录进程，从而实现对目标基因表达的抑制^[18]。Peters等在2016年利用CRISPRi系统，对酿酒酵母中的多个基因进行高效的抑制，包括GPD1和GPD2这两个参与甘油生成关键酶的基因^[41]。他们发现，通过这种方式抑制这两个基因的表达，酵母中甘油的生成显著降低，乙醇的生成则显著提高，这对于提升酿酒工业的生产效率具有重要意义。借助该系统，最终提高了酿酒酵母中半胱氨酸和丝氨酸的产量，使其分别增加约3.7倍和2.5倍。这项研究拓宽了CRISPR-Cas12a在基因工程中的应用，并为氨基酸生产菌的多重代谢工程提供了强大的合成生物学工具。2020年，Wu和Li等首次报道了应用dCas9和ddCpf1实现对电活性细菌(exoelectrogens)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)中电子传递相关途径的抑制。这是环境工程领域首次引入CRISPR系统，用于解析环境微生物的解毒机制和强化电活性细菌的电子传递^[42-43]。

另一方面，CRISPRa系统则通过将激活效应元件，如将VP64融合至dCas9，与sgRNA共同引导至目标基因的上游区域，吸引转录激活复合体的结合，从而提高目标基因的表达。在2018年，Hu等成功地运用一种称为噬菌体辅助连续演化(PACE)的策略对Cas9进行改良，从而得到一个新的突变体，命名为xCas9^[44]。接着，他们将失活的xCas9 (dxCas9)与转录激活系统VPR (VP64-p65-Rta)结合，创造出dxCas9-VPR复合体。借助于绿色荧光蛋白(GFP)作为指示标记，他们成功地实现对目标基因转录的增强。2022 年，Guo等首次报道了通过定向改变Cas12a与crRNA相互作用的结构域，实现当crRNA浓度受限时胞内CRISPRa激活效率的提升^[21]。

这些例子都展示了CRISPRi和CRISPRa系统在微生物中的广泛应用潜力。通过精确地调控目标基因的表达，我们可以在不改变基因序列的前提下，研究基因的功能，调整微生物的代谢，甚至实现微生物的功能强化。然而，由于微生物种类繁多，每种微生物的生理代谢和生长特性各异，CRISPRi和CRISPRa系统在微生物中的应用仍需进一步的优化和拓展。

2.3 碱基编辑及CRISPR-转座酶介导的基因失活与精准插入

CRISPRi和CRISPRa技术打开了无需进行DNA断裂即可实现基因编辑的大门。受此启发，后续陆续出现无需断裂核酸即可进行碱基置换的碱基编辑器，以及结合转座酶即可实现外源基因精准插入的外源基因整合技术。

2016 年， Liu 等首次报道了碱基编辑技术，即通过dCas9或者Cas9n和大鼠胞苷脱氨酶 (APOBEC1)相结合，通过sgRNA的精确导向，实现了基因特定位点胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转换^[45]。值得注意的是，这一过程并未导致DNA双链断裂，也无需提供DNA修复模板，避免了传统基因编辑可能带来的损伤，同时实现了快速、高效的单碱基编辑。该技术不断发展，已被成功应用于多种细菌的基因编辑中，展现出广泛的实用性和潜力^[46-49]。在碱基编辑器的研究中，Liu等也不断进行技术创新和改良。他们通过定向进化获得自然界原本并不存在的腺嘌呤脱氨酶，将腺嘌呤脱氨酶与Cas9n结合，可以将腺嘌呤(A)转变为鸟嘌呤(G)，实现了更为多样的基因编辑^[50]。同时，他们对碱基编辑器的特异性和脱靶问题进行深入研究，提出并实践了一系列的改良策略，以提高编辑器的准确性和可靠性^[51-52]。除此之外，Liu等在2019年发展了先导编辑(prime editing)技术。先导编辑通过将Cas9n与逆转录酶相结合，使用一个名为“pegRNA ”(prime editing guide RNA)的向导RNA指导Cas9n和逆转录酶定位到目标DNA序列，并提供一个模板以引导所需的编辑。一旦先导编辑器(prime editor)到达目标位置，它会切断DNA的一个链，然后使用pegRNA作为模板复制新的DNA序列^[53]。据此，可以在目的位点实现DNA的插入、删除和替换。2021年，Lee等首次在大肠杆菌中布署了先导编辑器，然而1 bp碱基的删除效率只有40%。较低的编辑效率限制了先导编辑在微生物中的应用^[54]。

2019年，Zhang和Sternberg等分别在大肠杆菌中构建了CRISPR系统与转座酶联用的基因整合系统，可以实现外源基因的精准插入。Zhang等利用了蓝藻中CRISPR相关的转座酶(ShCAST)，成功地在大肠杆菌(E. coli)基因组特定位置插入大片段DNA^[55]。这种转座酶包含类似于转座子Tn7的转座酶亚基和属于V-K家族的CRISPR效应蛋白Cas12k。与前者仅仅使用Cas12k不同，Sternberg等利用了I-F CRISPR-Cas系统中的Cas8、Cas7、Cas6按1:6:1组成CRISPR相关复合物(Cascade)异多聚体，并与TnsA、TnsB、TnsC和TniQ组成的转座系统相结合，实现外源基因的精准插入^[56]。此后，Sternberg等将原来的三质粒系统整合为单质粒系统，并将之命名为INTEGRATE (insert transposable elements by guide RNA-assisted targeting)系统，在大肠杆菌中以近100%的效率插入10 kb的外源长基因^[57]。在CRISPR相关转座酶(CRISPR- associated transposase, CAST)系统的应用与优化方面，Yang等发展了快速染色体多拷贝整合(multi-copy chromosomal integration by CRISPR- associated transposase, MUCICAT)系统，可以靶向多个任意序列，实现多拷贝整合^[58]。同时他们在半透明假交替单胞菌(Pseudoalteromonas translucida) KMM520中还发现了新型高活性转座酶PtrCAST，在基因组范围内几乎都能实现100%的精准插入。Cheng等则在典型的电活性微生物希瓦氏菌中进一步优化了ShCAST系统，实现长达30 kb外源基因的整合。上述两套整合系统都规避了对基因组DNA的切割和对DNA损伤修复系统的利用，直接通过RNA引导的转座酶进行目的DNA的插入，开启了CRISPR在大片段DNA编辑领域的新篇章，将为生物工程和遗传研究提供更多可能。

2.4 CRISPR-Cas系统的其他技术

借助Cas9蛋白的独特特性，即其能特异性地识别并切割目标序列，研究者们开发出诸多前沿的应用技术。基于碱基编辑系统的启示，Moore等研究者在2018年首次精巧地构建并报道了一种被称为MutaT7的嵌合体^[59]。他们巧妙地将T7 RNA聚合酶与胞嘧啶脱氨酶融合，从而在细菌体内实现了从T7启动子起始位置开始的定点基因组突变，而突变的终止则通过设定一个特定的终止子实现。在此基础上，Álvarez等研究者对这一体系进行进一步的创新，开发了一种名为T7-DIVA的系统^[60]。这个系统与MutaT7嵌合体相比，有一个重要的区别，即它使用dCas9- sgRNA作为终止子来中断突变进程。更为重要的是，通过引入腺嘌呤脱氨酶，这一系统不仅可以实现靶向区域内胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化，也可以实现腺嘌呤到鸟嘌呤的转换，从而显著提高突变的性能。此外，Schaffer和Dueber领导的研究团队开发了CRISPR的另一种创新性应用——EvolvR，这是一种能够推动细胞内特定基因进行定向进化的平台^[61]。EvolvR通过将易错型DNA聚合酶连接到Cas9n上，当融合蛋白靶向到特定的核酸区域时，切割单链DNA并激活细胞自身的修复机制，在大约350 bp的范围内产生随机突变。这项技术使得细胞的突变效率提高了7 770 000倍，而且通过这种方法，研究者们成功地赋予细菌对壮观霉素(spectinomycin)的抗性。

综上，Cas蛋白的特异性识别和切割特性为微生物遗传工程提供了一种全新的工具。MutaT7嵌合体和T7-DIVA系统的成功构建以及EvolvR的开发，在提高细胞基因突变效率、扩大突变类型以及拓宽突变范围等方面都取得显著的成效。这些技术的应用，尤其是在微生物定向进化领域，为我们解析微生物生理代谢、提升生物制品生产效率以及开发新型抗生素提供了无限的可能性。不仅如此，这些技术为我们提供了新的思路和工具来进行更深入的微生物学研究，对于解决人类面临的各种环境、健康等问题，都将起到至关重要的作用。

3 CRISPR-Cas系统驱动的病原体诊断

在现代医院体系的“分级诊疗”模式中，不同级别的医疗机构按照疾病的轻重缓急及治疗的难易程度分工负责。在这样的大背景下，“健康中国”战略与“精准医疗”计划，无不对“体外诊断”技术的发展起到引领作用。目前，体外诊断技术具有以下两大发展趋势：

(1)便携性和用户友好度：当今的检测设备、试剂及技术，正朝着操作简洁、便于携带、用户友好的方向发展。这个变化趋势正在改变检验过程，使其不再被限制在中心实验室，而是可以直接在患者周围完成。这种变革既提高检测的时效性，节约时间和成本，同时也使得检测结果更准确地反映患者的真实生理状态，从而更好地辅助预防和治疗工作。

(2)精准医学：该领域的目标是最小化医源性损伤、最优化诊疗成本，同时最大化患者的益处。这就要求在预防、诊断和治疗患者疾病的过程中，需要掌握的信息量急剧增加。因此，临床诊断正朝向高度自动化、智能化、高通量检测、高速分析、高速数据传输和高精度检测等方向发展。

CRISPR-Cas系统中Cas蛋白附属切割活性的发现促进了病原体诊断的发展，其快速的应用显著推动了体外诊断技术的发展。

3.1 Cas蛋白的附属切割活性的发现

2015年，Zhang等发现了一种可以靶向RNA并进行切割的蛋白质——Cas13蛋白^[62]。有趣的是，在RNA切割后，Cas13会展现出其RNA核酸酶的特性，对附近的RNA进行无差别切割，这个现象被称为“附属切割”^[39]。Doudna等在2016年认识到这种附属切割活性可以用来检测病原体的核酸^[63]。随后，Zhang等在2017年利用Cas13的附属切割活性与RPA恒温扩增技术相结合，实现了对阿摩尔(amol/L)浓度的多种病原体的检测，这项技术被命名为SHERLOCK^[19]。

与此同时，在2015年，Zhang等鉴定出一种与Cas9蛋白功能不同的V型CRISPR系统——Cpf1(后来被重新命名为Cas12)^[64]。Cas12可以在crRNA的引导下实现对双链DNA的切割。在2018年，Doudna和Wang等同时发现Cas12也具有附属切割功能，并据此分别开了DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)和HOLMES(one hour low-cost multipurpose eﬃcient simple nucleic acid detection system)技术^[23-24]。与SHERLOCK技术相比，这两项技术更为简洁，仅需要扩增目标核酸，然后激活Cas12的附属切割活性，对带有荧光和淬灭基团标记的单链DNA进行无差别切割，进而将核酸信息转化为荧光信号。

随后Doudna等在一批未培养的古菌中发现了一种只有400～700个氨基酸的Cas蛋白质—— Cas14(后来被称为Cas12f)^[65]。他们证实Cas14也具有对单链DNA的附属切割能力，而且与Cas12a和Cas12b不同，Cas14的靶标只能是单链DNA而不能是双链DNA。在此基础上，Doudna等开发了Cas14-DETECTR技术。该技术使用一个5′端标记硫代磷酸基团的引物扩增目标核酸，然后用T7外切酶去除未被标记的DNA链，剩余的DNA链就会触发Cas14的附属切割作用。

2022年日本科学家Tomoji Mashimo等首次在I类CRISPR中发现了具有附属切割活性的Cas3蛋白^[66]。他们在体外重建了CRISPR-Cas3系统，发现大肠杆菌的Cas3(EcoCas3)和EcoCascade对特定的DNA具有降解作用，并对非特异性的单链DNA展现出附属切割活性。基于这个发现，他们开发出类似DETECTR技术的CONAN (Cas3-operated nucleic acid detection)技术。值得注意的是，Taylor等在2023年发现了一种更为特殊的CRISPR核酸酶——Cas12a2^[67-68]。这种蛋白质在 gRNA的引导下识别入侵的RNA时，其核酸酶活性会被激活，在切割靶标RNA的同时，还会降解细胞内的其他RNA和DNA，抑制细菌的生长并使其进入休眠状态，从而限制病毒的传播。Cas12a2的特殊之处在于，它既对RNA具有附属切割活性，也对单链DNA具有附属切割活性，这为核酸检测提供了更多的可能性。在核酸检测方法的设计上，荧光和淬灭基团标记的探针可以是RNA，也可以是单链DNA。

CRISPR-Cas系统的附属切割功能甚至扩展到蛋白酶活性。2022年，Cas7-11的独特属性被陆续揭示^[69-71]。研究者们证实Cas7-11是一种新近发现的III-E亚型CRISPR-Cas相关系统，由4个Cas7和1个Cas11结构域融合形成的大分子效应蛋白，具有核酸酶和蛋白酶的双重活性。在靶向RNA存在的情况下，Cas7-11会激活并切割Csx29蛋白，进而切割Csx30蛋白。通过工程化的荧光标记Csx30蛋白变体，研究者们证明了在体外这种蛋白可以检测到低至250 fmol/L的RNA。

3.2 新一代诊断技术——CRISPR-Dx的发展

CRISPR-Cas系统首先进入到病原微生物诊断领域的蛋白是仅具有特异性识别与切割作用的Cas9蛋白。2016年，Pardee等将核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)与Cas9核酸酶集成至纸片，构造出一种被称为NASBACC (NASBA-CRISPR cleavage)的新型核酸检测平台^[72]。该平台通过运用NASBA及其衍生技术来扩增并反转录目标RNA片段，并与β-半乳糖苷酶的表达系统进行耦合。在sgRNA的引导下，Cas9成功地识别并切割扩增产物中的待检测dsDNA片段，进而导致β-半乳糖苷酶的表达受阻。反之，如果β-半乳糖苷酶成功表达，将能催化黄色底物(氯酚红-β-D-半乳糖苷)转化为紫色产物，从而以直观的颜色信号实现对核酸靶标的检测。

2017年，Zhang等基于Cas13蛋白的附属切割活性引进了SHERLOCK技术，为CRISPR-Cas系统在病原微生物诊断领域的应用带来了巨大的进步，标志着新一代诊断技术——CRISPR诊断(CRISPR-Dx)的诞生^[20]。随后，基于Cas12蛋白附属切割活性的DETECTR技术和HOLMES技术的出现，进一步推动了CRISPR-Dx技术的发展(图5)^[73]。同年，Zhang等还开发了SHERLOCK 技术的升级版本SHERLOCKv2，通过利用不同Cas13同源蛋白对于报告探针序列差异识别的特性，筛选出多组正交的诊断系统，实现了对病原体的多重检测^[74]。此外，这项工作首次将胶体金试纸条与CRISPR-Dx技术相结合，解决了显示所需的仪器依赖。随后，Sabeti和Blainey等在SHERLOCK技术的基础上，开发了CARMEN(combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids)技术^[75]。在CARMEN平台上，他们采用了一个微流控芯片，可以实现将含有待检测样本的多个扩增体系与含有Cas13核酸检测试剂的多个纳米液滴进行随机配对和融合。这种芯片可以形成数万甚至上十万个液滴的组合，因此理论上具有极强的检测能力。

图5 基于Cas12a和Cas13a的CRISPR-Dx技术的检测流程^[73]

在广泛应用初期的CRISPR-Dx技术后，研究者开始期望将CRISPR-Dx技术发展成便携式现场检测(point-of-care testing, POCT)技术^[76]。POCT技术的一条主线是开发出无需扩增即能进行核酸检测的方法。Zhou等首先提出，通过减小单个反应体系的体积来增加靶标浓度，从而实现痕量核酸的检测。他们首先将靶标核酸与CRISPR-Cas13a反应试剂在微液滴反应器中富集，以此提高靶标核酸的局部浓度，其检测限相较于常规大体积反应体系提高了1万倍^[77]。在几乎使用相同策略的研究中，Cas12a也实现了高灵敏度的无需扩增检测能力^[78]。随着微流控技术日益成熟，将CRISPR-Dx、电化学和微流控技术整合的核酸检测系统，可以对miRNA进行无需扩增直接检测^[79]。2021年，Doudna等采用附属切割活性最佳的LbCas13a蛋白，在SARS-CoV-2的N基因上通过选择最优的crRNA并进行组合，最终实现在无需扩增的情况下对新冠病毒的检测^[80]。而Nie等通过设计自反馈的级联放大回路CONAN，实现对低至100 amol/L的目的核酸的检测^[81]。

POCT的另一条主线是将扩增与Cas介导的检测在单管(one-pot)中同步进行，以避免气溶胶污染。然而，单管检测系统的固有问题在于Cas蛋白介导的特异性切割可能会在扩增尚未完全开始之前就裂解目标核酸，从而使二者难以兼容。为解决这一问题，研究者们进行了一系列的优化和创新。例如，Wang等经过多次优化^[82]，将LAMP扩增与Cas12b一同放在一个试管中进行，实现了边扩增边检测，但检测限还是相对偏高，只能达到10-5 nmol/L。随后，Zhang等基于LAMP与更高效的AapCas12b，系统地筛选反应添加剂并进行繁琐的引物和sgRNA优化，最终建立了一个高灵敏度的单管检测系统(SHERLOCK testing in one pot, STOP Covid)^[83]。此外，通过优化反应试剂和装置也可以实现单管检测。例如利用蔗糖浓度形成液面分层，添加甘油使得反应体系更加黏稠、分子运动更加困难，或者将Cas12a和crRNA放置于管壁或管盖上进行物理隔离^[84-85]。Zhou等巧妙地利用光控技术来控制crRNA的沉默与激活，成功解决了RPA等温扩增和CRISPR-Cas12a检测体系的兼容性问题^[86]。此外，Yin等通过使用靶向次优PAM的crRNA，能够削弱Cas蛋白的切割活性，从而实现了低至1 amol/L的单管检测^[87]。在环境工程领域，Cheng等使用次优PAM策略，构建了靶向抗生素抗性基因的单管检测系统，期望推动可持续的城市水循环检测系统^[88]。

综上，CRISPR-Dx作为一种新兴的基因编辑诊断技术，具有高灵敏度、特异性强且操作简便的特点。经过不断地迭代优化，其将广泛应用于传染性疾病的快速检测、遗传病筛查以及个性化医疗中的精准诊断等领域。

4 结语

随着人类活动对生态环境的影响日益加剧，功能和病原微生物的研究已成为全球关注的焦点。CRISPR系统所提供的多种技术与方法，为研究和应对这些挑战提供了宝贵的工具。然而，仍有一些关键问题亟待解决。首先，尽管已有许多研究显著推动了CRISPR系统的应用进展，其在不同微生物中的适用性仍需进一步探索和优化。对于一些难以培养或进行遗传操作的微生物，还需要开发更加精细、灵活的遗传工程策略。其次，尽管基于CRISPR-Dx的病原体实时监测已经取得突破性进展，但在全球范围内的应用仍受基础设施、经济、技术和人员培训等多种因素的限制。因此，必须加强政府、企业、学术机构和公共卫生组织之间的合作，推进这一技术的普及和应用。未来，需要深入研究微生物与病原体的相互作用、传播机制及其对人类健康的影响，以期为公共卫生安全、环境保护和可持续发展提供更科学、有效的策略和建议。同时，环境中复杂的微生物体系可作为研究对象，挖掘其中蕴藏的基因和蛋白资源，开发出更先进、高效、低成本的基因编辑技术。

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本文刊载于《自然杂志》2024年第5期

DOI：10.3969/j.issn.0253-9608.2024.05.001

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