植物单倍体诱导的方法、应用及展望

学术   2024-09-24 14:59   北京  

单倍体育种技术可以极大地提高育种效率。单倍体诱导的产生主要包括体外配子体组织培养和体内染色体消除。文章综述了体内单倍体诱导的几种策略及其发展和应用,还对目前单倍体诱导系的作用机制进行了介绍,并重点介绍了着丝粒蛋白CENH3介导的单倍体诱导机制。

作者|杨延铭,王娜

上海师范大学 生命科学学院


单倍体是其染色体组数量与配子体相同,或是体细胞一半的生物或个体。单倍体育种技术是将单倍体植株通过染色体组加倍获得纯合的双单倍体(doubled haploid)植株,只需2代便可得到纯合的双单倍体系,极大地缩短了育种周期,提高了育种效率[1]。此外,加倍后的双单倍体在每个基因座上均为纯合,能简化基因互作,去掉超显性效应,提高有利基因的选择效率[2]。双单倍体技术如果与种质扩增和育种材料的改良结合起来,先对目标诱导材料进行有效的重组改良累积足够的有利基因位点,然后再利用双单倍体技术获得纯系,将会极大地发挥双单倍体育种的优势[3]。因此,单倍体技术被称为育种技术的“黑马”。


单倍体于1920年首次在一种被称为“man cotton”的海岛棉中发现[4],不久有细胞学证据的单倍体存在于曼陀罗花中也被报道[5]。当时认为只是植物的偶然现象,随后陆续在烟草[6]、小麦[7]及其他几个物种[8]中也发现了自然发生的单倍体现象。但是总体而言,单倍体自然发生的概率极低[2,9],人工诱导是获得单倍体的主要途径。人工诱导单倍体的方法分为体外诱导和体内诱导(图1)。体外诱导方法包括体外培养花药、胚珠、雌蕊、小孢子等配子体[10-14],这种方法具有培养效率低、受基因型限制、愈伤组织诱导率和绿苗分化率极低等缺陷[15-16]。体内诱导方法主要通过各种杂交使某一单亲的染色体组在合子形成时或形成后发生消除,从而产生单倍体,包括远缘杂交、孤雌生殖、花粉处理和利用单倍体诱导系杂交。前三种体内诱导方法存在诱导频率极低、效果不稳定、不同基因型间差异大,以及获得种子量少等问题。利用单倍体诱导系来诱导获得单倍体的方法不受基因型限制,诱导效率高且效果稳定,已成为当下单倍体研究的前沿领域。本文主要对几种体内单倍体诱导方法的研究进展进行介绍和讨论。

1

种内杂交产生单倍体


目前,单倍体育种的商业价值在玉米育种中发挥到最大程度。玉米主要包含两种种内单倍体诱导体系,即基于indeterminate gametophyte 1 (ig1)突变体的单倍体诱导和基于玉米自交系Stock6的单倍体诱导。其中,ig1突变体是在自交系Wisconsin-23(W23)中发现的,其作为父本杂交时可以产生3%的单倍体诱导率(haploid induction ratio, HIR),该诱导系最终产生的单倍体含有母本的细胞质和父本配子的基因组[17]。研究者通过精细定位分析,得出IG1基因位于第3号染色体,并编码了一个含有LOB(lateral organ boundaries)结构域的蛋白[18]。含有该结构域的蛋白组成LBD(lateral organ boundaries domain)蛋白家族,LOB结构域被认为对植物的侧器官发育至关重要[18]。在ig1突变体中,转座子插入编码LOB结构域上游的外显子导致基因突变。虽然ig1突变体具有单倍体诱导效应,但是其雌配子的形成也受到影响:突变体中雌配子体核分裂周期和微管蛋白表现异常,导致ig1胚囊中的某些细胞有丝分裂异常。另外还观察到细胞核的不规则定位,不同对细胞核中出现非同步微管模式以及异常的成膜细胞[19]。异常的细胞增殖,导致ig1突变体的胚囊中出现过多的卵细胞、助细胞和中央细胞,这些异常表型的出现表明IG1是影响细胞从生长到分化的关键因子[18]。由于胚囊结构异常,许多ig1突变体会导致异常胚胎内核和微型胚乳的出现,进而引起早期种子败育[18]。更重要的是,ig1突变体导致单倍体产生的具体分子机制也不甚清楚,这些都限制了ig1单倍体诱导体系的应用。

图1 单倍体产生的途径

Stock6是玉米中最早发现的单倍体诱导系,最初报道的单倍体诱导率为2.3%~3.2% [20]。随后,一些研究小组和育种家将这一创始系的单倍体诱导能力引入不同的遗传背景,从而进一步建立杂交种,这成为许多目前使用的诱导系,如RWS[21] 、UH400[22]、CAU5[23]等的基础,其单倍体诱导率提高为7%~16%。目前,在诸多Stock6衍生的单倍体诱导系中,已经鉴定到8个位于6个不同染色体上的数量性状位点 (quantitative trait locus, QTL) ,这表明Stock6衍生的单倍体诱导是一个复杂的多因素控制的数量性状[22-26]。其中,qhir1(chr1)和qhir8(chr9)是两个主效QTL位点,分别解释了66%和22%的遗传变量,也间接说明其他的位点单独突变不足以诱导单倍体的产生[22,27]qhir1在Stock6中起着至关重要的作用,2017年3个不同的实验室分别鉴定到qhir1位点中的关键基因,将其命名为MTL/ZmPLA1/NLD[28-30]。在诱导系中,该基因的第4个外显子上有4个碱基对的插入,这导致在插入位点之后的20个氨基酸序列发生改变并且产生一个终止密码子,翻译的提前终止致使29个氨基酸缺失。该基因编码了一种花粉特异性的磷 脂酶A,其在营养细胞中表达但不在精细胞中表达。进一步亚细胞定位分析显示,在胚乳质膜中检测到MTL/ZmPLA1/NLD,这是一种源自营养细胞的特殊膜,包围着花粉中的两个精子细胞。值得注意的是,该4碱基插入突变只在诱导系中发生,在玉米的祖先大刍草中却未检测到,暗示了该突变发生在玉米驯化之后[29]MTL/ZmPLA1NLD在谷物中非常保守,水稻和小麦中MTL/ZmPLA1/NLD同源基因的突变也引发了相应的单倍体诱导,尽管在双子叶植物中没有发现存在MTL/ZmPLA1/NLD的同源基因。但是,该突变如何影响MTL/ZmPLA1/NLD的功能以及该突变如何产生单倍体的分子机制并不清楚。随后,qhir8位点上的基因ZmDMP也被克隆出,并且对mtl/zmpla1/nld突变体中的ZmDMP进行敲除后发现,单倍体诱导率增强了5~6倍[31],说明qhir8可能作为qhir1的增强子发挥作用,在含有qhir1位点突变的植株中,qhir8的叠加突变可以显著提高其单倍体诱导效率。另外,不仅是单子叶植物,在双子叶植物拟南芥中,ZmDMP的同源基因AtDMP8AtDMP9突变后也可以产生单倍体,其诱导效率在1.0%~3.2%[32]。最近的一项研究利用反向遗传学策略在玉米中定位到一个新的与单倍体诱导相关基因ZmPLD3,其编码一个磷脂酶D3并在谷物中高度保守。zmpld3突变发生在mtl/zmpla1/nld中后使得后者的单倍体诱导效率提高近3倍(从1.19%至4.13%)[33]。但是与zmpld3相比,zmpld3-zmdmp的平均HIR并没有显著增加,尽管zmpld3的HIR显著高于zmdmp,这暗示着ZmPLD3ZmDMP之间几乎没有发生相互作用。这些结果表明,尽管ZmPLD3MTL/ZmPLA1/NLD都属于磷脂酶家族,但是ZmPLD3可能在与MTL/ZmPLA1/NLD平行的不同途径中起作用,从而维持两者对单倍体诱导的协同作用[33]。这说明Stock6衍生的单倍体诱导系中的HIR是由多个不同途径的基因引起的,将这些基因叠加在一起可以明显增强HIR。分离单倍体诱导所需的新基因将有助于培育具有高HIR的单倍体诱导系,并进一步阐明单倍体诱导的潜在机制。


目前,研究发现与Stock6单倍体诱导相关的蛋白均为磷脂酶家族蛋白。近年来,关于这些调控脂质平衡的蛋白突变如何导致单倍体形成的机制有了一些初步进展。2017年,研究者通过单细胞单核基因组测序技术,发现单倍体诱导系成熟花粉的精细胞中存在高比例的染色体片段化,证明发生于花粉有丝分裂时期的精子染色体片段化是造成受精后染色体消除及单倍体诱导的直接原因,因此提出精细胞片段化是mtl/zmpla1/nld诱导单倍体产生的细胞学基础[34]。但是磷脂酶A蛋白突变如何导致精细胞染色体片段化的分子机理并不清楚。最近一项研究发现精细胞中的活性氧(ROS)增加是导致玉米单倍体诱导的关键因素。单倍体诱导发生是由于精细胞的ZmPLA1失活导致周边卵磷脂(PC)积累,使线粒体紊乱造成活性氧爆发,破坏精细胞染色体的稳定性致使染色体片段化,从而导致单倍体诱导发生[35]。该研究对zmpla1和野生型花粉的转录组、蛋白组、蛋白修饰组、单核基因组、代谢组和脂质组等全面分析,发现单倍体诱导系的ROS及能量相关途径基因表达发生大规模改变。过氧化物酶POD是 细胞防御ROS的主要工具,研究者通过CRISPR/Cas9技术将三核花粉期特异表达的过氧化物酶基因ZmPOD65敲除后引发了单倍体诱导效应,证明ZmPOD65是一个全新的单倍体诱导基因。随后,为了研究zmpla突变体中ROS爆发的原因, 基于ZmPLA的磷脂酶活性,体外实验表明只有卵磷脂可以引起ROS的改变,这表明zmpla突变体影响了脂质,特别是其中卵磷脂的失衡,导致ROS爆发进而引发了精细胞的染色体断裂和单倍体诱导。另外,体外实验用影响ROS水平的化学物质处理野生型花粉能够诱导单倍体[35]。该研究相对清楚地解析了mtl/zmpla1/nld中单倍体诱导的分子机制,发明了用化学物质处理花粉以诱导单倍体的技术,具有重大理论意义和实际应用价值。

另外,在一些物种中,不同倍性个体的种内杂交也可产生单倍体。如银背委陵菜的单倍体是由二倍体和四倍体杂交获得的[36],单倍体柑橘是由二倍体和三倍体杂交产生的[37-38]。将二倍体雄性不育且具有绿色下胚轴的甜菜与纯合的红色下胚轴四倍体饲料甜菜杂交获得甜菜单倍体[39-40]


2

种间杂交诱导单倍体的产生


不同物种间杂交是产生单倍体的有效方法之一,并且已经在许多物种间得到成功应用。目前已经在超过100个杂交组合中发生了单亲基因组消除的现象,包含75个单子叶物种和26个双子叶物种[41]。这个现象最初是在大麦中被发现的[42]。在二倍体多棱大麦(母本)与二倍体球茎大麦(父本)的合子中,球茎大麦的染色体消失,产生多棱大麦的单倍体[42-44]。该单倍体诱导方法被用于小麦及其他作物的常规育种项目,通过将这些物种与玉米或其他远缘作物品种杂交来获得单倍体[45-47]。这些杂交产生的单倍体诱导效率取决于遗传和实验因素[48-49],包括早期胚胎发育阶段的光强等[50]。这种单倍体诱导方法的缺陷是仅适用于某些物种。

细胞学分析揭示单亲染色体的消除发生在早期杂种胚发育过程的有丝分裂阶段[42]。已有研究发现在哺乳动物[51]、秀丽隐杆线虫[52]和黑腹果蝇[53]中,着丝粒特异组蛋白CENH3的缺失会导致着丝粒形成和染色体分离的失败。为了探究亲本染色体消除的原因,研究者检测了球茎大麦与多棱大麦的杂交合子中CENH3的变化。有趣的是,在杂交合子中球茎大麦染色体上的CENH3减少或者消失了[54],并且无论多棱大麦作为父本 还是母本杂交后代的单倍体中保留的都是多棱 大麦的染色体组[42]。目前,研究者认为在球茎大麦与多棱大麦的杂交组合中,球茎大麦的配子本身具有完整的CENH3,但是在形成合子后多棱大麦的CENH3优先翻译并正确装载到属于多棱大麦的染色体上。由于两个物种细胞周期的差异,球茎大麦的CENH3并不能及时装载,最终使得球茎大麦染色体的着丝粒随着有丝分裂的进行不断地减少,直至降至不能支持其继续分裂便形成微核,随后消失了。另外,也有研究者认为着丝粒大小是种间杂交产生单倍体的重要原因之一。当一个具有大着丝粒的物种与一个具有小着丝粒的物种杂交,来自小着丝粒物种的染色体会消失,从而产生单倍体[55]。研究者发现大约有24例的亲本染色体消失是由着丝粒大小引起的,包括大麦、燕麦、小麦(着丝粒相对大的物种)与高粱、玉米、珍珠粟、薏米和多年生黑麦草(着丝粒相对小的物种)之间的杂交产生单倍体[55]。这些研究说明存在多种机制来揭示种间杂交后单亲基因组消失的现象。

3

CENH3着丝粒特异组蛋白介导的

单倍体诱导


如前文所述,在广泛的物种杂交中CENH3活性的差异会导致单亲染色体的消除,最终产生单倍体。着丝粒由特殊的染色质与纺锤丝附着点(动粒)组装而成,作为一种多蛋白复合物,其中的着丝粒DNA在不同物种中是多变的,但是动粒蛋白却十分保守(图2)。正因为着丝粒复杂的组装机制与分子构成,在大多数植物和动物中着丝粒并不是用某一段序列来定义的,而是通过组蛋白H3变体CENP-A/CENH3的存在来定义的[56]。CENH3包含一个高度保守的C端组蛋白折叠域HFD(histone fold domain)和一个从核小体核心颗粒突出的高变 N端尾部[57],其N端结构域的序列在不同植物中差别较大,被认为参与减数分裂过程中CENH3的装载并调控细胞分裂[58-61]。CENH3在着丝粒中的关键作用表明,转录、翻译、修饰或掺入中的任何错误都可能影响完整动粒的组装,从而可能导致着丝粒功能异常甚至失活[62]。在动物和真菌研究中早有报道着丝粒特异性组蛋白H3变体的功能,如哺乳动物中的CENP-A[56]、酵母中的CSE4[63]和线虫中的HCP-3[64]。已有充分的证据表明,CENH3与构成动粒的某些关键蛋白之间存在直接的生化联系,并参与了染色体分离过程。在植物中,RNAi介导的拟南芥CENH3的敲除植株表现出有丝分裂减少导致植株矮小、减数分裂异常导致不育的表型[65]。这很大程度上印证了CENH3对染色体的分离至关重要。

图2  染色体的着丝粒组成与CENH3的蛋白结构示意图:(a)染色体的着丝粒区域结构与组成;(b) CENH3的蛋白结构与已报道的突变位点

在深入剖析CENH3功能之余,基于CENH3的单倍体诱导系的发展也在同步推进。2010年Ravi和Chan发现了一个突破性的单倍体诱导方法,在模式植物拟南芥中将经过改造的CENH3互补到cenh3缺失突变体中,使用该互补植株与野生型拟南芥杂交可以产生单倍体,其诱导效率高达25%~45%[66]。这种方法产生的单倍体中只含有野生型拟南芥的染色体组。文章中介绍了一种名为“GFP-tailswap”的转基因单倍体诱导系:作者构建了一个拟南芥转基因株系GFP-tailswap,将CENH3的N端替换为H3.3的N端尾巴,并在其N端连接绿色荧光蛋白。cenh3-/-纯合突变致死,但是将转基因株系GFP-tailswap转入cenh3-/-突变体中后,cenh3-/-的致死表型得到恢复并表现出较强的不育性,这表明减数分裂出现了异常。利用GFP-tailswap株系(母本)与野生型(父本)杂交,后代出现了较高比例的单倍体个体。当GFP-tailswap作为父本与野生型进行杂交也同样获得了单倍体,但是其比例却小得多。 无论哪一种杂交方式,单倍体中的染色体组均来自野生型。除此之外,研究者发现其他形式的CENH3变体也能在拟南芥中诱导单倍体, 但其诱导效率各有不同。例如,将玉米或其他种属的CENH3尾巴(tail)替代拟南芥CENH3自身尾巴并互补至cenh3-/-中也能诱导单倍体[60](图3(a))。通过改变CENH3的N端结构域产生了单倍体诱导系,这是一个具有划时代意义的发现。

图3  CENH3介导的单倍体诱导系的转基因(a)与非转基因(b)策略示意图。在CENH3介导的单倍体诱导系中首先都需要敲除原物种的CENH3得到cenh3 null突变体,除了CENH3(+/-)杂合突变体介导的单倍体诱导途径外,其余都需要依靠人工或自 然变异创制CENH3变体


CENH3 的C 端折叠结构域HFD 的一部分即由loop1和α2螺旋组成的靶向结构域被称为CATD(CENP-A targeting domain),已被证实对CENH3靶向着丝粒至关重要[58,67-70]。有研究表明,在哺乳动物和果蝇的HFD结构域上,部分氨基酸的改变降低了CENP-A和CID在着丝粒上的稳定性[71-72]。这一现象与上述改造CENH3的N端造成的影响类似,表明HFD结构域的改变可能产生单倍体诱导效应。随后在植物中的研究也证明了CENH3的HFD结构域修饰可以产生单倍体诱导系[73-75]。Karimi-Ashtiyani等人[73]由大麦入手通过EMS诱变得到了一株位于CATD结构域上的“Hvßcenh3 L92F”突变植株,但是由于大麦存在αCENH3和βCENH3两种CENH3变体且两种变体存在功能冗余,导致该突变株并没有产生单倍体诱导效应。随后研究者以大麦L92F位点为基础在拟南芥中引入L130F点突变,成功获得了拟南芥单倍体诱导系[74]。同时Kuppu等人[74]通过分析多个物种的CENH3同源性和保守结构域HFD中的可耐受残基位点,将不同点突变后的CENH3回补到cenh3缺失突变体中,得到的株系自交可育并与野生型杂交后产生单倍体,这表明通过EMS诱变只需得到相同位点的突变便可以获得有效的单倍体诱导系,且不需要转基因[74]。2020年Kuppu等人[75]构建了HFD结构域中的双点突变体,并且利用CRISPR/Cas9系统创制了αN螺旋的缺失突变体,将这些突变体回补到cenh3缺失突变体中,产生的株系均具有单倍体诱导效应。有趣的是,作者还发现在某些双点突变叠加后,其单倍体诱导效率明显高于单点突变的现象[75](图3(b))。EMS诱变和CRISPR/Cas9系统都不属于转基因的统筹范围,这些研究可能为单倍体诱导系的快速商业化奠定了基础。另外,与tailswap-CENH3不同,基于CENH3蛋白HFD结构域的突变并没有直接影响植株正常的有丝分裂与减数分裂,自交可育。这种单倍体诱导系的发现可能比tailswap-CENH3诱导系更有竞争力和应用价值,毕竟配子的大量产生将会直接提高杂交成功率。改变CENH3的蛋白结构以定向削弱着丝粒而产生单倍体诱导系,具有以下特点:①改变CENH3的N端高变尾部的 “GFP-tailswap”拥有较高的单倍体诱导效率,但是诱导系本身是不育的;②定点突变CENH3蛋白C端保守的HFD区域产生的一系列点突变诱导系本身自交可育,但是单倍体诱导效率相对较低。

最近的一项研究发现植物生长的环境温度会极大地影响基于CENH3的单倍体诱导效率[76]。该研究发现拟南芥中的高效单倍体诱导系GFP-tailswap的花粉活力和单倍体诱导效率对其生长温度高度敏感,提高温度可以提高单倍体诱导效率,但会造成诱导系的花粉活力下降,而低温有利于提升花粉活力。进一步实验表明,温度对单倍体诱导效率的影响主要发生于受精后,这暗示着温度对单倍体诱导效率和花粉活力的影响是相互独立的。因此可以使用低温生长条件下的花粉在高温条件下诱导母本单倍体,从而最大程度地优化母本单倍体的诱导。通过此方法,当GFP-tailswap诱导系做母本时其诱导效率可以高达80.5%[76]。尽管该研究的实验都是在拟南芥中进行的,但其理论为作物中基于CENH3的单倍体诱导系的推广提供了关键性线索。我们期待在作物中也能够通过对生长温度的调节从而极大地 优化单倍体诱导效率。

尽管CENH3在植物中是普遍存在的,且功能上具有较高的保守性,但是其在作物中的应用依旧艰难。早期以CENH3为基础的单倍体诱导系在作物中的诱导效率都比较低,Kalinowska等人[77]将这些工作进行了完善的总结和综述。在番 茄中,CENH3蛋白N端一个碱基的突变导致第9个氨基酸由赖氨酸替换为谷氨酸,当这个突变体与野生型杂交后,其后代出现了4%的双单倍体[78]。 在水稻中,CENH3中氨基酸替换突变体作为诱导系产生了1%的单倍体[76]。最近基于着丝粒的单倍体诱导方法在作物中取得了一系列突破性的进展。在小麦的研究中发现了一个切实可行的基于CENH3的父本单倍体诱导系,其单倍体诱导率约为7%。与拟南芥不同,编辑后的等位基因在雌配子体中的传播效率降低,杂合基因型组合比 纯合组合引起更高的单倍体诱导率[79]。小麦为异源六倍体,含有三个亚基因组,存在多个拷贝的CENH3基因。该研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术定向改变了小麦CENH3α蛋白的N端尾巴,同时使用两个gRNA使得CENH3的N端缺失一小段但HFD结构域保持完整。与此同时敲除了其余等位基因,产生了一个称之为修复移码(restored frameshift, RFS)的突变,这可以一定程度上消除其他等位基因功能冗余的影响。后续通过异交,检测不同基因型突变植株的单倍体诱导效率,证实了RFS等位基因和未经修饰的TaCENH3α-A等位基因的杂合(+/r)组合,加上其他等位基因的敲除(+/r,-/- ,-/-),导致了较高的父系单倍体诱导效率(8%)。而RFS的纯合突变株系(r/r ,-/-,-/-)的单倍体诱导率只有不到2%。对于这种令人惊奇的杂合基因型更有效的诱导单倍体现象,作者解释为CENH3α-A的正常表达对于配子体的发育至关重要,而r突变体中的着丝粒染色质可能会异常。来自杂合基因型(+/r)胚囊的着丝粒染色质比来自RFS纯合突变系(r/r)胚囊的更加不稳定,因为来自(r/r)的胚囊已经经历了整整一代的时间来适应r基因带来的着丝粒不稳定,但是 (+/r)在胚囊形成前着丝粒保持着与野生型相同的强度[79]。紧接着一项玉米中的研究[80]更是印证了CENH3杂合突变体诱导单倍体的可行性。鉴于cenh3纯合突变体的胚胎致死效应,作者在利用CRISPR-Cas9技术创制cenh3缺失突变体的同时,引入了一个外源immune-CENH3(此外源基因与内源CENH3序列相同,只是在gRNA区域有5个密码子改变从而避免被CRISPR/Cas9靶向敲除),该外源基因可以回补cenh3缺失突变体的致死表型。之后作者将带有immune-CENH3cenh3缺失突变体与野生型杂交获得了+/cenh3杂合株系,通过异交实验验证了无论+/cenh3杂合突变体作为父本还是母本与野生型杂交,其后代都会产生单倍体。但是当+/cenh3杂合突变体作为母本进行杂交时,其单倍体诱导效率更高[80]。由于雌性杂交后代中只有25%的后代获得了cenh3,作者发现有效单倍体诱导率可以达到20%。这种单倍体诱导现象被认为是由配子体中着丝粒关键蛋白CENH3的稀释导致的[80]。带有cenh3等位基因的配子体必须使用孢子体时期携带的CENH3,而CENH3在每个细胞周期都会被自然稀释,因此携带cenh3的精子和卵子中CENH3蛋白大大减少,从而导致其具有较小的着丝粒,进而导致单倍体的形成。这是一种高度简化的单倍体诱导系统,该系统基于cenh3 null杂合突变体。这一方 法的主要优点是:可以用来创制父本或母本单倍体且不需要转基因;由于诱导系是杂合子,cenh3/+与任何品系杂交后F1将成为单倍体诱导系,进一步缩短育种时间。当与其他基于单倍体的技术结合使用时(如不依赖于基因型的基因 编辑及无融合生殖等),此功能会发挥更大的作用。在标准育种实践中,单倍体诱导的效率很可能会提高。在世界各地的多种育种项目中,原本在Stock6[20]初始品系中观察到3%的单倍体诱导率已经提高到15%左右[28],因此基于着丝粒的单倍体诱导系的诱导效率有望得到进一步提升。

CENH3介导的染色体消除的普遍机制仍然不明朗。已经有研究者提出了着丝粒大小与单倍体形成之间的关系:当一个具有较小/有缺陷着丝粒的株系与具有较大/正常着丝粒的株系杂交时,较小/有缺陷的着丝粒优先降解,导致染色体从具有较小着丝粒的亲本中消除[55]。与此观点一致,在果蝇中通过人为靶向蛋白降解系统来降低CENH3的量会产生单倍体[81]。这一系统也可应用于作物中,例如26S蛋白酶体靶向降解系统已经在烟草中得到成功应用[82]。最近对拟南芥中染色体消除现象的研究结果进一步验证了着丝粒大小与单倍体形成之间的关系。细胞学实验发现在拟南芥中,CENH3的改变导致其选择性地从成熟卵和早期合子的着丝粒中去除,而野生型CENH3仍然存在。在杂交合子和胚胎的细胞分裂中,CENH3耗尽的“弱”着丝粒必须与野生型着丝粒竞争CENH3负载。由于协同结合,野生型着丝粒受到青睐并优先加载CENH3和其他着丝粒必需蛋白,而CENH3缺失的着丝粒无法重建新的CENH3染色质。在随后的有丝分裂中,HI染色体由于着丝粒较弱而错误分离,野生型染色体分离正常进行而形成了单倍体[83]。同时,研究发现在拟南芥中E3泛素连接酶VIM1是染色体消除的拮抗因子[83]。VIM1作为一种甲基胞嘧啶结合蛋白,可导致着丝粒重复序列低甲基化、着丝粒去浓缩和着丝粒CENH3密度降低。vim1缺失突变体叠加cenh3单倍体诱导系会极大增加单倍体的诱导效率。亲本CENH3多态性导致其着丝粒在表观遗传上表现不同,这导致亲本间强大的交配屏障产生并进一步引起单倍体的形成。在作物中复制拟南芥HI系统的困难可以解释为CENH3的组装和调控具有物种特异性[79-80],高等植物中可能具有更复杂的纠错机制。GFP-tailswap的改变在拟南芥中是可行的,但在玉米中是致死的[80]。同时,在玉米中使用cenh3杂合突变体可产生5%的单倍体,在拟南芥中产生<1%的单倍体,而在小麦中则没有[79-80]。在每个物种中设计有效的单倍体诱导系可能需要不同类型的CENH3修饰, 因为CENH3变体的功能在不同物种中可能受到不同的限制。直接操纵配子中CENH3的去除可能是一种更简单而普遍的策略[83](图3(b))。

4

双单倍体在作物育种中的应用


作物品种的选育与生产需要纯系,然而在传统的育种方法中,这些品系是通过近亲经历7~9代杂交才能达到育种所需要的纯合水平。相比之下,单倍体经过秋水仙素处理后染色体加倍产生双单倍体,可以在2代中实现高品质的纯合品系,极大程度地缩短了育种时间。双单倍体的这些特性和独特的完全纯合性质使其对于育种有着极高的应用价值,如品种的早期开发、种质开发、特定性状的转移、转基因植物的快速生产[11,84-85]。另一方面,双单倍体对于基础研究也有着极高的应用价值,包括理解复杂数量性状的遗传机制、定位多基因关联的数量性状位点(QTL)、基因组学研究和基因鉴定、全基因组图谱等[11,86-88]。双单倍体系在常规的分子育种、遗传学、数量遗传学、基因组学和生物技术领域的应用,表明了双单倍体系作为一种理想材料在这些领域中的重要性。这里主要介绍几种双单倍体在植物育种和分子遗传上的应用。

4.1  新品种培育


传统育种是对遗传变异和基因重组产生的性状进行人工筛选,通过自交或杂交的方式验证并将理想性状固定下来。随着分子育种技术的快速发展,人为定向产生可遗传变异成为可能[89]。 在育种过程中缩短育种年限、快速固定所需性状是改进育种方法的主要目标[90]。双单倍体可以在2代内迅速获得纯合株系,将新品种的培育时间缩短了3~5代,有助于在育种过程中高效、准确地获得理想性状,而且这些双单倍体品系可以直接作为普通栽培品种上市或者作为种质资源进行储存。在同样的背景下,双倍体(DH)技术有可能减少常规杂交育种过程中出现的不利性状,例如杂交过程中的自交不亲和性、转基因和基因编辑过程中的半合子现象[2,91]。双单倍体技术结合标记辅助选择(MSA)与基因组选择(GS)可以进一步对质量和数量性状进行有效选择,大大提高育种效率[92-94]。目前,结合双单倍体、MSA与GS技术已经在许多作物的不同性状改良中得到应用。例如,小麦赤霉病抗性[95]、条锈病抗性[96]、水稻稻瘟病抗性[97]等植物病害抗性的筛选与导入。玉米的育种与性状改良效率也因为单倍体和双单倍体技术的应用,使得隐性基因分离并表现出的概率得到大幅提高[93,98]。双单倍体技术在芸薹属植物育种中应用非常广泛,许多甘蓝型油菜和大多数目前种植的加拿大油菜品种来自双单倍体育种技术[99]。另外,在菜花、木薯等植物中,由于其后代的高度杂合性使得育种工作相当困难[100-101],单倍体与双单倍体技术将在这些作物的育种工作中非常有用。

4.2 植物基因编辑技术与单倍体诱导相结合的HI-EDIT体系

CRISPR/Cas9技术进行基因编辑是作物育种的有力工具。此方法依赖于植物转化技术,而植物转化技术又高度依赖植物基因型,因此对绝大多数农作物品种来说,基因编辑技术的应用受到极大限制。近年来,一种称为“HI-EDIT” 的技术应运而生,该系统利用带有CRISPR/Cas9技术的玉米单倍体诱导系进行基因组编辑,并且在玉米、小麦、拟南芥上的初步试验都获得了成功[102-103]。该系统将CRISPR-Cas9盒转入单倍体诱导系,然后通过与需要基因编辑的近交系植株杂交,在合子阶段完成基因编辑,带有CRISPR-Cas9盒成分的来自诱导系基因组在单倍体形成后丢失,只剩下编辑过的近交系基因组。后续编辑的单倍体经过秋水仙素加倍以产生具有纯合突变的基因编辑植株。由于DH纯系的获得需要2代,HI-EDIT系统能够跳过耗时长的回交转育,2代内即可在任何商业化近交系中实现特异遗传位点的分子设计。此外,近年来CRISPR/Cas9多基因敲除技术的发展迅速,一个载体中可以携带多个gRNA,使得HI-EDIT系统能够同时实现多个遗传位点的编辑。除此之外,对于一些不能进行遗传转化的品系,HI-EDIT系统具有更重要的意义。HI-EDIT技术关键的成果在于利用单倍体诱导系与双单倍体的特性进行无转基因成分的基因编辑,不需要进行组织培养,不依赖于植物基因型而实现对近交系的基因编辑,因此具有广泛的应用前景,这也为后续的基因编辑植株的商业化应用提供了新思路。


目前已报道的HI-EDIT研究大多在MTL介导的Stock6及其衍生物单倍体诱导系基础上进行基因编辑的[102-103]。但是,这种方法比较复杂,因为它与基因编辑技术结合之前需要在另一个遗传背景下生成matl隐性纯合突变体。此外,matl只能在作为雄性杂交时诱导单倍体,仅产生具有同源细胞质和核基因组的单倍体。更重要的是,matl突变体如何引起单倍体诱导的机制尚不清楚。另一方面,基于CENH3的单倍体诱导系为cenh3杂合突变体[80],生长健壮并且在遗传上具有显性优势(与任何株系杂交一代即可产生单倍体),将比Stock6衍生系更有优势。基于CENH3的诱导系在杂交中作为雄性和雌性都可诱导单倍体,这一特性使其有很大的应用价值,能够产生任何目标基因组背景的单倍体。当其作为雌性时,可以将父本的核基因组转移到异源细胞质中,创建细胞质雄性不育系。着丝粒介导的单倍体诱导机制是已知的,基因组消除发生在合子受精后,能够确保基因编辑元件(如来自单倍体诱导系亲本的CRISPR/Cas9和gRNA盒)传递至受精卵中,从而保障基因编辑的成功。因此,将基于CENH3的单倍体诱导应用于基因型独立的基因编辑将会非常有价值。


4.3  无融合生殖植株的创制


杂种优势是指杂种一代在生长发育、抗逆以及环境适应性等方面都优于双亲的现象[104]。杂种优势在农业上被广泛应用,为全世界粮食安全问题作出了突出贡献。然而,由于有性生殖过程中的染色体重组事件,杂种优势无法在F1自交后代中保持,杂交种子的生产每年需要消耗大量的人力、物力和财力。因此,固定作物杂种优势将简化制种过程,具有显著的经济效益。令人欣慰的是,研究者发现无融合生殖是一种固定F1代杂种优势的有效方法[105]。无融合生殖是指植物绕过正常减数分裂与受精过程并形成克隆种子的一种无性生殖方式。无融合生殖为直接生产杂交种子提供了可能性,这将进一步加快育种过程[106]。已有文章报道在水稻中通过同时突变三个减数分裂关键调控基因PAIR1REC8OSD1,获得的三突变植株中减数分裂被类似有丝分裂(mitosis instead of meiosis, MiMe)行为替代并产生与亲本基因信息完全相同的克隆配子[107]。克隆配子正常受精后会形成四倍体,因此需要进行染色体的消除。随后作者通过编辑单倍体诱导基因MTL在水稻中成功获得了二倍体克隆种子[108]。但是与传统杂交种子相比,基于MTL的单倍体诱导系植株的生长状况受到影响,结实率低,影响了克隆种子的产量,限制了其在作物育种中的实际应用。MiMe植株的创制已经不是一个难以攻克的问题,目前亟待解决的问题是如何建立高效可用的单倍体诱导系并与MiMe植株结合应用。以着丝粒特异组蛋白CENH3为基础的单倍体诱导系为杂合突变体,生长健壮[80],有望在克隆种子的产生方面有更好的表现。另外,由于PAIR1REC8OSD1CENH3这四个基因在作物中的保守存在[107,109],如小麦、大麦、小米等,其产生的克隆种子在其他谷物中也能得到广泛应用。

5

总结与展望


目前我们有多种策略来诱导单倍体的产生,这些策略的逐渐成熟也使单倍体和双单倍体有更多应用价值。但是,单倍体诱导技术的发展仍然存在一些问题。首先,除体外培养雌雄配子外,大部分体内诱导单倍体的机制尚不明确。尽管对于Stock6衍生的单倍体诱导系的潜在基因和功能有了初步解析,但是对于其单倍体产生的机制仍然没有一个较为明确的解释。远源物种杂交与CENH3介导的单倍体诱导机制被解释为着丝粒的稀释作用使其变得弱小,从而在与野生型竞争时装载异常导致单倍体的形成,但是着丝粒装载过程的具体影响及着丝粒功能缺失导致单倍体形成的分子机制仍然有待挖掘。单倍体诱导机制的进一步解析会更有利于其在育种和基础研究中的应用。其次,除了大多数研究者聚焦的单倍体诱导率如何继续提高之外,制约单倍体技术与其他应用结合的最大因素是单倍体诱导系往往伴随着一定程度的不育性[79-80]。包括基于CENH3的GFP-tailswap在内的所有体内诱导系都存在一定程度的不育表型,而较早发现的Stock6衍生的单倍体诱导的不育现象最初也被认为是其诱导单倍体的原因[26,110]。然而在对玉米mtl突变体的研究分析中发现,mtl配子体在减数分裂中染色体的频繁断裂可能是其诱导单倍体和育性下降的原因,但是仍然缺乏一些遗传学证据[34]。近来在CENH3中发现的杂合突变体诱导单倍体的过程简单,其育性不受影响,单倍体诱导系生长健壮[79-80],有望解决单倍体诱导系育性过低的问题。

总之,目前普遍认为单倍体诱导的原因是单亲染色体组的消除。其中以Stock6所衍生的单倍体诱导策略应用较多,也正是由于该QTL位点广泛分布在植物体中,这也使得该策略在多个重要作物中的应用成为可能。同时,CENH3在不同物种间也具有高度保守性,其介导的单倍体诱导系具有广泛的应用价值,并且该诱导系可通过操纵生长温度从而优化单倍体诱导效率,cenh3杂合突变体具有与野生型相似的育性成为该策略的优势。单倍体的发展毫无疑问可以极大地加快作物育种时间和分子机制的解析,新基因的发掘以及相关互作蛋白的筛选仍然是单倍体机制解析和生产应用的重要研究方向。


参考文献


向上滑动阅览


[1] SEYMOUR D K, FILIAULT D L, HENRY I M, et al. Rapid creation of Arabidopsis doubled haploid lines for quantitative trait locus mapping [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(11): 4227-4232.

[2] DWIVEDI S L, BRITT A B, TRIPATHI L, et al. Haploids: constraints and opportunities in plant breeding [J]. Biotechnol Adv, 2015, 33(6): 812-829.

[3] 张如养, 段民孝, 赵久然, 等. 单倍体技术在玉米种质改良和育种中的应用方向[J]. 作物杂志, 2012(5): 4-8.

[4] HARLAND S C. A note on a peculiar type of “rogue” in Sea Island cotton [J]. Agr News Barbados, 1920, 19: 29.

[5] BLAKESLEE A F, BELLING J, FARNHAM M E, et al. A haploid mutant in the jimson weed, “Datura stramonium” [J]. Science, 1922, 55(1433): 646-647.

[6] CLAUSEN R E, MANN M C. Inheritance in Nicotiana tabacum [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1924, 10(4): 121-124.

[7] GAINES E F, AASE H C. A haploid wheat plant [J]. Am J Bot, 1926, 13(6): 373-385.

[8] KIMBER G, RILEY R. Haploid angiosperms [J]. Bot Rev, 1963, 29(4): 480-531.

[9] DUNWELL J M. Haploids in flowering plants: origins and exploitation [J]. Plant Biotechnol J, 2010, 8(4): 377-424.

[10] MALUSZYNSKI M, KASHA K J, EORSTER B P, et al. Doubled haploid production in crop plants: a manual [M]. New York: Springer Science & Business Media, 2003.

[11] TOURAEV A, FORSTER B P, JAIN S M. Advances in haploid production in higher plants [M]. Dordrecht: Springer, 2008.

[12] OHKAWA Y, SUENAGA K, OGAWA T. Production of haploid wheat plants through pollination of sorghum pollen [J]. Japan J Breed, 1992, 42(4): 891-894.

[13] RIERA-LIZARAZU O, MUJEEB-KAZI A. Polyhaploid production in the triticeae: wheat × tripsacum crosses [J]. Crop Sci, 1993, 33(5): 973-976.

[14] LAURIE D A, O'DONOUGHUE L S. Wheat × maize crosses for the production of wheat haploids [M]//BAJAJ Y P S. Maize. Heidelberg: Springer, 1994: 102-118.

[15] PREMVARANON P, VEARASILP S, THANAPORNPOONPONG S N, et al. In vitro studies to produce double haploid in Indica hybrid rice [J]. Biologia, 2011, 66(6): 1074-1081.

[16] MALUSZYNSKA J. Cytogenetic tests for ploidy level analyses—chromosome counting [M]//MALUSZYNSKI M, KASHA K J, FORSTER B P, et al. Doubled haploid production in crop plants. Dordrecht: Springer, 2003: 391-395.

[17] KERMICLE J L. Androgenesis conditioned by a mutation in maize [J]. Science, 1969, 166(3911): 1422-1424.

[18] EVANS M M S. The indeterminate gametophyte1 gene of maize encodes a LOB domain protein required for embryo sac and leaf development [J]. Plant Cell, 2007, 19(1): 46-62.

[19] HUANG B Q, SHERIDAN W F. Embryo sac development in the maize indeterminate gametophyte1 mutant: abnormal nuclear behavior and defective microtubule organization [J]. Plant Cell, 1996, 8(8): 1391-1407.

[20] COE E H JR. A line of maize with high haploid frequency [J]. Am Nat, 1959, 93(873): 381-382.

[21] ROEBER F, GORDILLO G A, GEIGER H H. In vivo haploid induction in maize - Performance of new inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding [J]. Maydica, 2005, 50(3): 275-283.

[22] PRIGGE V, XU X, LI L, et al. New insights into the genetics of in vivo induction of maternal haploids, the backbone of doubled haploid technology in maize [J]. Genetics, 2012, 190(2): 781-793.

[23] HU H, SCHRAG T A, PEIS R, et al. The genetic basis of haploid induction in maize identified with a novel genome-wide association method [J]. Genetics, 2016, 202(4): 1267-1276.

[24] DONG X, XU X, MIAO J, et al. Fine mapping of qhir1 influencing in vivo haploid induction in maize [J]. Theor Appl Genet, 2013, 126(7): 1713-1720.

[25] LASHERMES P, BECKERT M. Genetic control of maternal haploidy in maize (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines [J]. Theoret Appl Genetics, 1988, 76(3): 405-410.

[26] BARRET P, BRINKMANN M, BECKERT M. A major locus expressed in the male gametophyte with incomplete penetrance is responsible for in situ gynogenesis in maize [J]. Theor Appl Genet, 2008, 117(4): 581-594.

[27] LIU C, LI W, ZHONG Y, et al. Fine mapping of qhir8 affecting in vivo haploid induction in maize [J]. Theor Appl Genet, 2015, 128(12): 2507-2515.

[28] KELLIHER T, STARR D, RICHBOURG L, et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction [J]. Nature, 2017, 542(7639): 105-109.

[29] LIU C, LI X, MENG D, et al. A 4-bp insertion at ZmPLA1 encoding a putative phospholipase A generates haploid induction in maize [J]. Mol Plant, 2017, 10(3): 520-522.

[30] GILLES L M, KHALED A, LAFFAIRE J B, et al. Loss of pollenspecific phospholipase not like dad triggers gynogenesis in maize [J]. EMBO J, 2017, 36(6): 707-717.

[31] ZHONG Y, LIU C, QI X, et al. Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize [J]. Nat Plants, 2019, 5(6): 575-580.

[32] ZHONG Y, CHEN B, LI M, et al. A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in the dicotyledonous Arabidopsis [J]. Nat Plants, 2020, 6(5): 466-472.

[33] LI Y, LIN Z, YUE Y, et al. Loss-of-function alleles of ZmPLD3 cause haploid induction in maize [J]. Nat Plants, 2021, 7(12): 1579-1588.

[34] LI X, MENG D, CHEN S, et al. Single nucleus sequencing reveals spermatid chromosome fragmentation as a possible cause of maize haploid induction [J]. Nat Commun, 2017, 8(1): 991.

[35] JIANG C, SUN J, LI R, et al. A reactive oxygen species burst causes haploid induction in maize [J]. Mol Plant, 2022, 15(6): 943-955.

[36] ASKER S. A monoploid of potentilla argentea [J]. Hereditas, 1983, 99(2): 303-304.

[37] OIYAMA I, KOBAYASHI S. Haploids obtained from diploid × triploid crosses of citrus [J]. J Japan Soc Hort Sci, 1993, 62(1): 89-93.

[38] GERMANÀ M A, CHIANCONE B. Gynogenetic haploids of Citrus after in vitro pollination with triploid pollen grains [J]. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2001, 66(1): 59-66.

[39] BOSEMARK N O. Haploids and homozygous diploids, triploids and tetraploids in sugar beet [J]. Hereditas, 2009, 69(2): 193-203.

[40] CISTUE L, ROMAGOSA I, TSUCHIYA T, et al. Karyotype analysis in haploid sugarbeet [J]. Bot Gaz, 1985, 146(2): 259-263.

[41] ISHII T, KARIMI-ASHTIYANI R, HOUBEN A. Haploidization via chromosome elimination: means and mechanisms [J]. Annu Rev Plant Biol, 2016, 67: 421-438.

[42] KASHA K J, KAO K N. High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.) [J]. Nature, 1970, 225(5235): 874-876.

[43] GERNAND D, RUTTEN T, PICKERING R, et al. Elimination of chromosomes in Hordeum vulgare × H. bulbosum crosses at mitosis and interphase involves micronucleus formation and progressive heterochromatinization [J]. Cytogenet Genome Res, 2006, 114(2): 169-174.

[44] FU S, YIN L, XU M, et al. Maternal doubled haploid production in interploidy hybridization between Brassica napus and Brassica allooctaploids [J]. Planta, 2018, 247(1): 113-125.

[45] SIDHU P K, HOWES N K, AUNG T, et al. Factors affecting oat haploid production following oat × maize hybridization [J]. Plant Breed, 2006, 125(3): 243-247.

[46] PRATAP A, SETHI G S, CHAUDHARY H K. Relative efficiency of different Gramineae Genera for haploid induction in triticale and triticale × wheat hybrids through the chromosome elimination technique [J]. Plant Breed, 2005, 124(2): 147-153.

[47] KOMEDA N, CHAUDHARY H K, SUZUKI G, et al. Cytological evidence for chromosome elimination in wheat × Imperata cylindrica hybrids [J]. Genes Genet Syst, 2007, 82(3): 241-248.

[48] BITSCH C, GRÖGER S, LELLEY T. Effect of parental genotypes on haploid embryo and plantlet formation in wheat × maize crosses [J]. Euphytica, 1998, 103(3): 319-323.

[49] GARCIA-LLAMAS C, RAMIREZ M C, BALLESTEROS J. Effect of pollinator on haploid production in durum wheat crossed with maize and pearl millet [J]. Plant Breed, 2004, 123(2): 201-203.

[50] CAMPBELL A W, GRIFFIN W B, BURRITT D J, et al. The importance of light intensity for pollen tube growth and embryo survival in wheat × maize crosses [J]. Ann Bot, 2001, 87(4): 517-522.

[51] HOWMAN E V, FOWLER K J, NEWSON A J, et al. Early disruption of centromeric chromatin organization in centromere protein A (Cenpa) null mice [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(3): 1148-1153.

[52] OEGEMA K, DESAI A, RYBINA S, et al. Functional analysis of kinetochore assembly in Caenorhabditis elegans [J]. J Cell Biol, 2001, 153(6): 1209-1226.

[53] BLOWER M D, DAIGLE T, KAUFMAN T, et al. Drosophila CENP-a mutations cause a BubR1-dependent early mitotic delay without normal localization of kinetochore components [J]. PLoS Genet, 2006, 2(7): e110.

[54] SANEI M, PICKERING R, KUMKE K, et al. Loss of centromeric histone H3 (CENH3) from centromeres precedes uniparental chromosome elimination in interspecific barley hybrids [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(33): E498-E505.

[55] WANG N, DAWE R K. Centromere size and its relationship to haploid formation in plants [J]. Mol Plant, 2018, 11(3): 398-406.

[56] WARBURTON P E, COOKE C A, BOURASSA S, et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres [J]. Curr Biol, 1997, 7(11): 901-904.

[57] MCKINLEY K L, CHEESEMAN I M. The molecular basis for centromere identity and function [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2016, 17(1): 16-29.

[58] LERMONTOVA I, SCHUBERT V, FUCHS J, et al. Loading of Arabidopsis centromeric histone CENH3 occurs mainly during G2 and requires the presence of the histone fold domain [J]. Plant Cell,

2006, 18(10): 2443-2451.

[59] RAVI M, SHIBATA F, RAMAHI J S, et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana [J].

PLoS Genet, 2011, 7(6): e1002121.

[60] MAHESHWARI S, TAN E H, WEST A, et al. Naturally occurring differences in CENH3 affect chromosome segregation in zygotic mitosis of hybrids [J]. PLoS Genet, 2015, 11(1): e1004970.

[61] ZHANG X, LI X, MARSHALL J B, et al. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation [J]. Plant Cell, 2005, 17(2): 572-583.

[62] ALLSHIRE R C, KARPEN G H. Epigenetic regulation of centromeric chromatin: old dogs, new tricks? [J]. Nat Rev Genet, 2008, 9(12): 923-937.

[63] STOLER S, KEITH K C, CURNICK K E, et al. A mutation in CSE4, an essential gene encoding a novel chromatin-associated protein in yeast, causes chromosome nondisjunction and cell cycle arrest at mitosis [J]. Genes Dev, 1995, 9(5): 573-586.

[64] BUCHWITZ B J, AHMAD K, MOORE L L, et al. A histone-H3-like protein in C. elegans [J]. Nature, 1999, 401(6753): 547-548.

[65] LERMONTOVA I, KOROLEVA O, RUTTEN T, et al. Knockdown of CENH3 in Arabidopsis reduces mitotic divisions and causes sterility by disturbed meiotic chromosome segregation [J]. Plant J, 2011, 68(1): 40-50.

[66] RAVI M, CHAN S W L. Haploid plants produced by centromere mediated genome elimination [J]. Nature, 2010, 464(7288): 615-618.

[67] RAVI M, KWONG P N, MENORCA R M G, et al. The rapidly evolving centromere-specific histone has stringent functional requirements in Arabidopsis thaliana [J]. Genetics, 2010, 186(2): 461-471.

[68] BLACK B E, FOLTZ D R, CHAKRAVARTHY S, et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin [J]. Nature, 2004, 430(6999): 578-582.

[69] BLACK B E, JANSEN L E T, MADDOX P S, et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-a targeting domain [J]. Mol Cell, 2007, 25(2): 309-322.

[70] SULLIVAN K F, HECHENBERGER M, MASRI K. Human CENP-A contains a histone H3 related histone fold domain that is required for targeting to the centromere [J]. J Cell Biol, 1994, 127(3): 581-592.

[71] TACHIWANA H, KAGAWA W, SHIGA T, et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A [J]. Nature, 2011, 476(7359): 232-235.

[72] ZHANG W, COLMENARES S U, KARPEN G H. Assembly of drosophila centromeric nucleosomes requires CID dimerization [J]. Mol Cell, 2012, 45(2): 263-269.

[73] KARIMI-ASHTIYANI R, ISHII T, NIESSEN M, et al. Point mutation impairs centromeric CENH3 loading and induces haploid plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(36): 11211-11216.

[74] KUPPU S, TAN E H, NGUYEN H, et al. Point mutations in centromeric histone induce post-zygotic incompatibility and uniparental inheritance [J]. PLoS Genet, 2015, 11(9): e1005494.

[75] KUPPU S, RON M, MARIMUTHU M P A, et al. A variety of changes, including CRISPR/Cas9-mediated deletions, in CENH3 lead to haploid induction on outcrossing [J]. Plant Biotechnol J, 2020, 18(10): 2068-2080.

[76] WANG Z, CHEN M, YANG H, et al. A simple and highly efficient strategy to induce both paternal and maternal haploids through temperature manipulation [J]. Nat Plants, 2023, 9(5): 699-705.

[77] KALINOWSKA K, CHAMAS S, UNKEL K, et al. State-of-the-art and novel developments of in vivo haploid technologies [J]. Theor Appl Genet, 2019, 132(3): 593-605.

[78] OP DEN C R H M, VAN DIJK P J, GALLARD A. Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants: WO 2017058022A1 [P]. 2017-04-06.

[79] LV J, YU K, WEI J, et al. Generation of paternal haploids in wheat by genome editing of the centromeric histone CENH3 [J]. Nat Biotechnol, 2020, 38(12): 1397-1401.

[80] WANG N, GENT J I, DAWE R K. Haploid induction by a maize cenh3 null mutant [J]. Sci Adv, 2021, 7(4): eabe2299.

[81] RAYCHAUDHURI N, DUBRUILLE R, ORSI G A, et al. Transgenerational propagation and quantitative maintenance of paternal centromeres depends on Cid/Cenp-a presence in Drosophila sperm [J]. PLoS Biol, 2012, 10(12): e1001434.

[82] BAUDISCH B, PFORT I, SORGE E, et al. Nanobody-directed specific degradation of proteins by the 26S-proteasome in plants [J]. Front Plant Sci, 2018, 9: 130.

[83] MARIMUTHU M P A, MARUTHACHALAM R, BONDADA R, et al. Epigenetically mismatched parental centromeres trigger genome elimination in hybrids [J]. Sci Adv, 2021, 7(47): eabk1151.

[84] BASU S, DATTA M, SHARMA M, et al. Haploid production technology in wheat and some selected higher plants [J]. Aust J Crop Sci, 2011, 5: 1087-1093.

[85] THOMAS W T B, FORSTER B P, GERTSSON B. Doubled haploids in breeding [M]//MALUSZYNSKI M, KASHA K J, FORSTER B P, et al. Doubled haploid production in crop plants. Dordrecht: Springer, 2003: 337-349.

[86] COLLARD B C Y, JAHUFER M Z Z, BROUWER J B, et al. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: the basic concepts [J]. Euphytica, 2005, 142(1): 169-196.

[87] KEARSEY M J. QTL analysis: problems and (possible) solutions [M]//Quantitative genetics, genomics and plant breeding. Wallingford UK: CABI publishing, 2002: 45-58.

[88] FORSTER B P, HEBERLE-BORS E, KASHA K J, et al. The resurgence of haploids in higher plants [J]. Trends Plant Sci, 2007, 12(8): 368-375.

[89] MCNALLY K L, CHILDS K L, BOHNERT R, et al. Genomewide SNP variation reveals relationships among landraces and modern varieties of rice [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(30): 12273-12278.

[90] AHMAR S, GILL R A, JUNG K H, et al. Conventional and molecular techniques from simple breeding to speed breeding in crop plants: recent advances and future outlook [J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(7): 2590.

[91] NIAZIAN M, SHARIATPANAHI M E. In vitro-based doubled haploid production: recent improvements [J]. Euphytica, 2020, 216(5): 69.

[92] TUVESSON S, DAYTEG C, HAGBERG P, et al. Molecular markers and doubled haploids in European plant breeding programmes [J]. Euphytica, 2007, 158(3): 305-312.

[93] LI J, CHENG D, GUO S, et al. Genomic selection to optimize doubled haploid-based hybrid breeding in maize [J]. BioRxiv, 2020: 287672.

[94] KRISHNAPPA G, SAVADI S, TYAGI B S, et al. Integrated genomic selection for rapid improvement of crops [J]. Genomics, 2021, 113(3): 1070-1086.

[95] YANG Z P, GILBERT J, SOMERS D J, et al. Marker assisted selection of fusarium head blight resistance genes in two doubled haploid populations of wheat [J]. Mol Breed, 2003, 12(4): 309-317.

[96] BAKHTIAR F, AFSHARI F, NAJAFIAN G, et al. Backcrossbreeding and doubled-haploid facilitated introgression of stripe rust resistance in bread wheat [J]. Arch Phytopathol Plant Prot, 2014, 47(14): 1675-1685.

[97] ARAÚJO L G, PRABHU A S, PEREIRA P A A, et al. Markerassisted selection for the rice blast resistance gene Pi-ar in a backcross population [J]. Cropp Breed Appl Biotechnol, 2010, 10(1): 23-31.

[98] GEIGER H H, ANDRÉS GORDILLO G, KOCH S. Genetic correlations among haploids, doubled haploids, and testcrosses in maize [J]. Crop Sci, 2013, 53(6): 2313-2320.

[99] FERRIE A M R, MÖLLERS C. Haploids and doubled haploids in Brassica spp. for genetic and genomic research [J]. Plant Cell Tiss Organ Cult, 2011, 104(3): 375-386.

[100] NIEUWHOF M. Pollination and contamination of Brassica oleracea L [J]. Euphytica, 1963, 12(1): 17-26.

[101] CEBALLOS H, KAWUKI R S, GRACEN V E, et al. Conventional breeding, marker-assisted selection, genomic selection and inbreeding in clonally propagated crops: a case study for cassava [J]. Theor Appl Genet, 2015, 128(9): 1647-1667.

[102] KELLIHER T, STARR D, SU X, et al. One-step genome editing of elite crop germplasm during haploid induction [J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(3): 287-292.

[103] WANG B, ZHU L, ZHAO B, et al. Development of a haploidinducer mediated genome editing system for accelerating maize breeding [J]. Mol Plant, 2019, 12(4): 597-602.

[104] BIRCHLER J A, YAO H, CHUDALAYANDI S, et al. Heterosis [J]. Plant Cell, 2010, 22(7): 2105-2112.

[105] SPILLANE C, CURTIS M D, GROSSNIKLAUS U. Apomixis technology development—virgin births in farmers' fields? [J]. Nat Biotechnol, 2004, 22(6): 687-691.

[106] 张燕, 王春, 王克剑. 人工创制植物无融合生殖的研究进展[J]. 科学通报, 2020, 65(27): 2998-3007.

[107] MIEULET D, JOLIVET S, RIVARD M, et al. Turning rice meiosis into mitosis [J]. Cell Res, 2016, 26(11): 1242-1254.

[108] WANG C, LIU Q, SHEN Y, et al. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes [J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(3): 283-286.

[109] BRITT A B, KUPPU S. Cenh3: an emerging player in haploid induction technology [J]. Front Plant Sci, 2016, 7: 357.

[110] SARKAR K R, COE E H. A genetic analysis of the origin of maternal haploids in maize [J]. Genetics, 1966, 54(2): 453-464.


本文刊载于《自然杂志》2024年第4期

DOI:10.3969/j.issn.0253-9608.2024.01.012
欢迎关注
欢迎转发朋友圈

《自然杂志》编辑部

地址:上海市上大路99号上海大学121信箱(200444)

邮箱:ziranzazhi@163.com

网址:http://www.nature.shu.edu.cn


长按二维码关注我们




点击 阅读原文 了解更多

自然撷英
《自然杂志》创刊于1978年5月,由上海市教育委员会主管,上海大学主办,双月刊。杂志主要刊载研究热点评述、综述和研究快报,介绍自然科学各研究领域的最新研究成果。欢迎关注!欢迎惠稿!
 最新文章