辅酶类核开关的种类、结构和调控机制研究进展

学术 2024-06-05 17:15 北京

摘要

核开关是一类保守的RNA元件，可以通过特异性识别小分子配体来开启或关闭下游相关基因的表达，进而调控细胞的生命活动。目前已鉴定出近60种核开关，它们分别识别不同的代谢物或小分子配体。随着这些核开关的发现，它们的序列特征、高级结构以及调控机制逐渐成为核开关领域的研究热点。截至目前，大部分核开关的三维结构已经被解析，相关研究不仅阐明了这些核开关对配体的特异性识别方式，还从分子层面阐释了其对下游基因表达的调控机制，为开发核开关相关应用提供了重要的研究基础。文章综述了目前已鉴定的核开关的种类和主要功能，详细探讨了辅酶类核开关的三维空间结构和配体识别机制，并展望了核开关的研究前景及潜在应用。

作者｜许笑晨^①②，任艾明^①

①浙江大学生命科学研究院/浙江大学医学院附属第二医院心内科；②中山大学附属第八医院

研究表明，在人类基因组中，大约有90%的基因可以被转录成RNA，但是只有不到2%的基因最终被翻译成蛋白质^[1]。这些不参与编码蛋白质的RNA被称为“非编码RNA”(non-coding RNAs)^[2]。越来越多的研究发现，非编码RNA种类繁多，具有丰富的生物学功能，可以参与调控细胞周期、细胞分化、表观遗传以及基因表达等各种生命活动^[3]。

核开关(riboswitch)是一类可以通过特异性地识别小分子配体来调控基因表达的非编码RNA，主要位于细菌mRNA的5´末端^[4]。这类RNA元件最早由耶鲁大学的Ronald Breaker教授课题组报道发现，他们于2002年鉴定了三类可以特异性识别不同辅酶因子的RNA片段，并且发现这些RNA片段可以参与调控相关辅酶的代谢通路，因此将其命名为“riboswitch”，即核开关^[5-7]。随后20多年，对核开关RNA分子的深入研究与系统探讨逐渐拓展了人们对核开关的结构与功能的认知和理解。

1 核开关的组成与调控机制

核开关通常由两个串联的功能结构域——“配体识别模块”(sensing domain)和“表达平台”(expression platform)组成。上游的“配体识别模块”一般具有较高的序列保守性，可以形成规整的三维结构和特定的配体结合口袋来识别配体，其构象会在识别配体的过程中发生变化；下游的“表达平台”通过基因表达组件与配体识别模块相连，其构象会随着配体识别模块的构象变化而变化，从而实现对下游基因表达的调控^[4]。

核开关对下游基因表达的调控既可以发生在转录过程中，也可以发生在翻译过程中(图1(a)和1(b))。在转录调控过程中，核开关在结合配体后通过促进或破坏转录终止信号的形成来控制RNA聚合酶的解离或结合，从而实现对下游基因表达的调控；在翻译调控过程中，核开关在结合配体后，通过释放或者屏蔽下游的核糖体结合位点来控制核糖体的结合或解离，从而调控下游基因表达^[4,8]。

图1 核开关的调控原理、种类和数量

研究表明，除了以上两种调控模式外，核开关还可以通过调控RNA分子的降解或剪接来控制下游基因的表达。比如，识别D-氨基葡萄糖6-磷酸的GlmS核开关是一类特殊的核开关，研究发现它同时也是一类核酶，可以在结合配体后启动其核酶的自剪切功能，引起整个RNA分子的降解，最终抑制下游基因的表达^[9]。还有研究发现，一些高等植物的TPP核开关可以通过结合配体引发mRNA的可变剪接，诱发mRNA的降解，进而抑制下游基因的表达^[10]。此外，部分c-di-GMP-II型核开关也被发现可以在结合配体后诱导其下游的I型自剪接核酶发生可变剪接，从而调控下游基因的表达^[11]。

2 核开关的种类

核开关主要存在于细菌、蓝藻等原核生物中，还有少量分布于真菌、水稻等真核生物中^{[2, 8]}。核开关的命名往往根据其识别的配体来定义，比如结合氟离子的核开关被称为氟离子核开关，结合甘氨酸的核开关被称为甘氨酸核开关，结合腺嘌呤的核开关被称为腺嘌呤核开关，等等^[12]。根据配体种类的不同，目前已鉴定的核开关通常被分为辅酶类核开关、嘌呤及其衍生物类核开关、信号分子类核开关、氨基酸类核开关、离子类核开关以及其他类型的核开关(图1(c))^[12-13]。

在已鉴定的核开关中，辅酶类核开关的数量十分丰富，几乎占据了已知核开关总量的一半，它们参与维持生物体内辅酶B₁₂、THF、NAD⁺以及SAM等大部分常见的辅酶类代谢物的稳态，精密地调控生命体的各种代谢过程；嘌呤及其衍生物类核开关可以识别的配体包括鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、2´-dG、ADP、ZTP以及PreQ₁等各种嘌呤类分子，它们参与调控细胞内的嘌呤代谢过程或维持嘌呤类分子的稳态；信号分子类核开关可以识别环二核苷酸c-di-GMP、c-di-AMP、c-AMP-GMP等第二信使并参与调控细菌的细胞周期、生物膜形成等重要的生理过程，还可以识别ppGpp并参与调控支链氨基酸的生物合成和转运；氨基酸类核开关可以识别的配体包含赖氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺，其中赖氨酸核开关与甘氨酸核开关参与调控细胞内相应氨基酸的稳态，两类谷氨酰胺核开关参与调控细胞的氮代谢过程。除了代谢物，核开关还可以精准地识别不同种类的离子，包括二价金属离子、一价金属离子以及阴离子——氟离子，这些离子类核开关主要参与调控离子转运蛋白的表达，维持细胞内离子的稳态。此外，还有几类识别其他代谢物的核开关，包括GlmS核开关和胍核开关等。GlmS核开关可以特异性地识别6-磷酸葡萄糖胺(GlcN6P)，控制革兰氏阳性菌中GlcN6P的合成。胍是鸟嘌呤的热分解产物，具有较强的细胞毒性，目前已鉴定出四类可以识别胍并参与调控胍的分解或排出的核开关^[12-13]。

除此之外，通过序列比对可以发现，自然界中还存在数量可观的保守性RNA结构域，它们具有核开关的结构特征，但是识别的配体尚未被鉴定出来，被统称为“孤儿核开关”(orphan riboswitch)。很多核开关在配体被鉴定之前均属于孤儿核开关，如氟离子核开关、c-di-AMP核开关等。孤儿核开关的配体鉴定通常具有一定的挑战性。比如，虽然体外实验发现孤儿核开关Yjdf结构域可以结合部分氮杂芳烃类化合物，但是其在细胞内识别的天然配体种类尚未被鉴定出来，其下游基因yjdf的功能也尚不清楚，均有待进一步研究^[14]。

3 辅酶类核开关的三维结构

核开关具有复杂的三维空间结构，可以形成特定的结合口袋来特异性地识别相应配体进而调控下游基因的表达。自第一个核开关被发现以来，以结构为基础阐述核开关对配体的识别机制和对下游基因表达的调控机制就是核开关研究领域的研究热点之一^[2,15-16]。截至目前，大部分核开关的三维结构已陆续被解析出来。在这篇综述中，我们将以辅酶类核开关为代表详细阐述核开关的三维结构与作用机制。

3.1 辅酶B₁₂核开关

识别辅酶B₁₂(图2(a)) 的腺苷钴胺素(adenosylcobalamin, AdoCbl)核开关是最早被报道的一类核开关，它可以在翻译水平上调控钴胺素转运蛋白的表达^[5]。随后，研究人员又在其初始序列中发现了一类结合羟钴胺素(aquocobalamin, AqCbl)的序列并将其命名为AqCbl核开关^[17]。目前，这两类辅酶B₁₂核开关的三维结构均已被解析。通过结构比较可以发现，这两类核开关均由多个发卡(hairpin)结构组成，其中二者的茎区(stem) P3、P4、P5和P6形成的多环分支结构相同，二者的不同点在于茎区P7的顶端是否存在延伸出去的茎区P8、P10和P11以及是否存在环区J1/3(图2(b))。在识别口袋内(图2(c)和2(d))，两类核开关通过分子间作用力识别配体，它们以相同的方式识别配体的钴胺素部分(相关核苷酸在图中用蓝色表示)，而识别配体的钴胺素衍生物部分的核苷酸则呈现不同的构象(相关核苷酸在图中用蓝绿色表示)^[17]。

图2 辅酶B₁₂核开关的二级结构图和三维结构结合口袋

3.2 TPP核开关

识别焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate, TPP)(图3(a))的核开关数量丰富，分布广泛，不仅存在于细菌中，在藻类、真菌和水稻等真核生物中也有发现^[7]。TPP核开关可以以30 nmol/L的亲和力结合TPP，通过转录抑制的方式调控硫胺素的合成^[7]。三维结构显示，TPP核开关的整体结构含有五个茎区P1~P5，其中茎区P1、P2和P3通过连续堆积形成一个同轴长螺旋，茎区P4和P5形成另一个长螺旋结构，两段长螺旋平行排列并通过环区J2/4相连(图3(b))。结构分析表明，TPP核开关的识别口袋由两部分构成，分别识别配体TPP的HMP(4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine)部分和PP(pyrophosphate)部分。茎区P2与环区J2/3参与识别TPP的HMP部分，其中G40和G19与HMP部分形成氢键相互作用，G42和A43通过堆积作用将HMP夹在中间，维持结合口袋的稳定；茎区P4和P5参与识别TPP的PP部分，其中C77与配体的PP部分形成氢键相互作用，两个金属离子(图中用绿色球状模型表示)介导了PP部分与其他核苷酸之间的相互作用(图3(c))^[18]。

此外，有研究鉴定出一类可以结合TPP代谢过程中的合成前体HMP-PP(图3(a))的this核开关，它可以在转录水平上调控焦磷酸硫胺素的合成^[19]。该类核开关的三维结构尚未被解析，其识别配体的模式还不清楚。

图3 TPP核开关的二级结构图和三维结构结合口袋

3.3 FMN核开关

黄素单核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)是黄素蛋白的辅酶(图4(a))，参与生命体氧化呼吸过程中的电子传递过程。FMN核开关以10 nmol/L的亲和力结合FMN，通过转录抑制的方式调控核黄素的合成与转运^[6]。FMN核开关的三维结构相对复杂，整体结构折叠为对称的蝴蝶状，主要由6个茎区组成(图4(b))^[20]。配体FMN结合在6个茎区的交汇处，其中环区J6/1的A99与FMN的多环结构尿嘧啶样边缘形成氢键相互作用，G10、G11、G32、G62和G84识别FMN的磷酸基团部分，还有部分核苷酸通过镁离子和水分子介导的配位作用参与识别配体(图4(c))^[20]。

图4 FMN核开关的二级结构图和三维结构结合口袋

3.4 SAM核开关家族

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)是生物体内甲基转移反应的“通用货币”，是最通用的辅酶因子之一(图5(a))。目前共发现9类识别SAM或其还原型产物SAH(S-adenosyl homocysteine)的核开关，它们在不同菌属中参与调控体内甲硫氨酸合成与代谢的不同阶段^[21-29]。根据序列保守性分析和结构特征比较，这些核开关又被分为四大家族^[30-40]。

SAM-I、SAM-IV、SAM-I/IV核开关的茎区P1、P2、P3和环区J1/2以及配体识别口袋的构象相同，它们又通过形成额外的茎区P4、P5或假结(pseudoknot) PK1、PK2来稳定各自的结构，这三类核开关被分为SAM-I核开关家族(图5(b))^[30,33,39]。在这些核开关的三维结构中，配体SAM的腺嘌呤部分主要由保守的碱基A和U识别，SAM的氨基酸部分则由三碱基对G-C-G识别，SAM的硫原子由两个尿嘧啶上的氧原子识别(图5(c))。

SAM-II和SAM-V核开关的整体结构均折叠成“H”型假结构象，它们被分为SAM-II核开关家族(图5(d))^[31,34]。二者通过形成相似的配体识别口袋将SAM结合在茎区P2和环区J1之间。在识别口袋内，配体SAM的腺嘌呤部分与保守的碱基U形成互补配对，SAM的氨基酸部分由保守的碱基A识别，SAM的硫原子由三碱基配对U-A-U识别(图5(g))。

SAM-III和SAM-VI的二级结构相似，但是二者的三维结构显示它们的配体识别口袋的构象不同，因此分别被分为SAM-III核开关家族(图5(e))和SAM-VI核开关家族(图5(f))^[32,35]。其中SAM-III型核开关将SAM结合在其三螺旋通路中靠近茎区P1的位置，SAM的腺嘌呤部分与G7和A38形成相互作用，SAM的硫原子与G36、U37和A39形成相互作用，SAM的糖环部分被G47的碱基和磷酸基团识别(图5(h))^[32]。而在VI型核开关中，SAM被结合在三螺旋通路中靠近茎区P2的位置，SAM的腺嘌呤部分由U8和三个形成堆积作用的A36、A37和G38识别，U8同时参与SAM氨基酸部分的识别固定，SAM的硫原子由U6参与识别(图5(i))^[35]。

除了识别SAM的核开关，还有研究鉴定出识别SAH的核开关。其中，SAM-SAH核开关既可以识别SAM又可以识别SAH，其二级结构与SAM-II核开关家族十分相似，三维结构也呈现“H”型假结构象，但是它结合配体的相互作用与SAM-II核开关家族不同^[36-37]。还有一类SAH核开关，它只能识别SAH而不识别SAM，其二级结构和三维结构特征与其他识别SAM的核开关完全不同^[38]。

图5 SAM 核开关的二级结构图和三维结构结合口袋

3.5 NAD⁺核开关

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺)又被称为辅酶I(图6(a))，在多种生理过程中发挥着传递电子、提供能量等重要作用，是生物体内至关重要的辅酶之一。2019年，第一类识别NAD⁺的核开关被鉴定发现，它主要存在于酸杆菌属中，由两个高度相似的发卡状识别模块串联组成(图6(b))^[41]。最初的研究发现第一个模块约以100 μmol/L的亲和力结合NAD⁺，而第二个模块识别的配体尚不清楚^[41]。NAD⁺-I型核开关的表达平台内存在核糖体结合位点，因此研究人员推测它可能在翻译水平上调控下游nadA基因的合成^[41]。随后，NAD⁺-I型核开关的三维结构研究显示这两个识别模块的整体结构相似，它们以相同的识别方式结合NAD⁺的ADP部分，而不结合NMN部分(图6(c)和6(d))。进一步的结构分析发现，三维结构中的远程相互作用直接影响两个识别模块结合配体的能力：在第一个识别模块中，环区J1和J2形成的远程相互作用稳定了RNA的整体折叠和配体识别口袋的形成；而第二个识别模块没有形成相应的远程相互作用，这致使它结合配体的能力大大降低(图6(c)和6(d))^[42]。基于这些研究，含有两个识别模块的NAD⁺-I型核开关对配体阶梯式响应的调控方式也被首次阐释^[42]。

2020年，第二类识别NAD⁺的核开关被报道发现，它主要存在于链球菌属中。该类核开关与NAD⁺的结合亲和力约为100 μmol/L，通过翻译抑制的方式调控烟酰胺核糖转运蛋白的合成(图6(e))^[43]。NAD⁺-II型核开关的三维结构显示其整体折叠为“Y”型构象，假结PK和茎区P1形成由3´末端单链J1K连接的同轴螺旋，茎区P1a垂直于该长螺旋伸出，配体NAD⁺结合在茎区P1和PK之间。与NAD⁺-I型核开关的配体识别方式不同，NAD⁺-II型核开关的结合口袋主要识别NAD⁺的NMN部分，其中核开关的G41和C54与配体的NMN部分形成三碱基配对，夹在由C5-G42-A53形成的三碱基对和由G6-U7-C40-A55形成的四碱基对之间(图6(f))^[44]。

图6 NAD⁺ 核开关的二级结构图和三维结构结合口袋

3.6 THF核开关

四氢叶酸(tetrahydrofolate, THF)又被称为辅酶F(图7(a))，主要参与体内嘌呤、嘧啶等物质的合成。THF-I型核开关以70 nmol/L的亲和力结合THF，在革兰氏阳性菌中调控叶酸转运蛋白或叶酸合成蛋白的表达(图7(b))^[45]。THF-I型核开关的三维结构显示其整体折叠为“Y”型三通路构象。一个核开关RNA分子结合两个THF配体，其中一个配体被结合在两个螺旋轴交叠的顶端，茎区P3的U25和C53与配体的四氢蝶呤部分形成氢键相互作用，茎区P2的G68堆积在THF的一侧(图7(d))；另一个配体结合在“三通路”的交汇处，三碱基对U7-U35-U42与配体的四氢蝶呤部分形成氢键相互作用(图7(e))^[46-47]。

THF-II型核开关主要存在于革兰氏阴性菌中，其以20 μmol/L的亲和力结合THF，在翻译水平上调控下游folE基因的表达，从而调控叶酸及其衍生物的合成(图7(c))^[48]。THF-II型核开关的三维结构显示其整体折叠成一个长螺旋轴，茎区P1和P2形成同轴螺旋，连接区J1/2连接两个茎区并形成配体识别口袋。结构分析显示，结合口袋处的C22和U44与配体的四氢蝶呤部分形成特异性的氢键相互作用(图7(f))^[49]。

图7 THF 核开关的二级结构图和三维结构结合口袋

3.7 钼辅因子核开关

在辅酶类核开关中，还有一类调控钼酸盐转运蛋白、钼辅因子合成酶表达的钼辅因子(molybdenum cofactor, MoCo)核开关和一类识别钨辅因子(tungsten cofactor, WCo)的WCo核开关^[50]。目前，这两类核开关的三维结构尚未被解析。

4 核开关的应用与展望

截至目前，越来越多的核开关被鉴定出来，它们分别识别不同种类的辅酶、信号分子、氨基酸以及嘌呤等重要的小分子，参与调控相关代谢物的生物合成或转运、有毒物质的排出，以及维持离子稳态等过程^[12-13,51]。随着对这些核开关的序列、调控功能和三维结构的深入研究，核开关的应用潜力逐渐被发掘出来。核开关的特性使得它们既可以作为药物靶标用于新型抗生素的研发，也可以用于开发生物传感器和生物成像，以及基因表达控制系统等应用工具^[52-53]。

如前文所述，核开关主要分布在细菌中，包括多类致病菌，它们参与调控细菌的各种代谢通路，对维持细菌生存十分重要^[16]。2005年，有研究发现TPP的结构类似物吡啶硫胺可以通过与TPP核开关结合来影响硫胺素的生物合成，从而抑制细菌生长^[54]。这一研究结果表明，致病菌中的核开关有望被当作药物靶标用于新型抗生素的研发。紧接着，基于TPP核开关的三维结构，一系列新型的TPP结构类似物被设计出来作为TPP核开关的竞争性抑制剂^[55-57]。随后，还有研究表明，玫瑰黄素、5FDQD和Ribocil等核黄素的结构类似物可作用于FMN核开关，在多种致病菌中产生抑菌活性^[58]。除此之外，使用特定的寡核苷酸来屏蔽致病菌中核开关与相应配体的结合，可抑制细菌的存活，也为以核开关为靶标的新型抗生素研发提供了新思路^[59]。

核开关可以高特异性、高亲和力地识别各类重要的代谢物，包括嘌呤、辅酶、离子、信号分子以及氨基酸等小分子，并且在结合相应配体后会发生构象变化。基于这一特点，将核开关与荧光蛋白或荧光RNA适配体相偶联，通过小分子代谢物控制核开关的构象变化，诱导下游荧光蛋白或荧光RNA适配体的表达，从而产生随着代谢物浓度升高而增强或减弱的荧光强度积累，可用于开发能够快速、灵敏地检测体内外环境中代谢物水平变化的生物传感器^[52]。目前，已有研究将Spinach适配体与辅酶、嘌呤及信号分子类核开关融合，应用于监测代谢物水平变化的生物传感器或生物成像工具^[60]。也有研究将GFP荧光蛋白与氟离子核开关串联，应用于检测环境中的氟化物水平^[61]。除此之外，基于核开关可以调控下游基因表达的特性，核开关还可被应用于构建新型基因表达调控系统，通过特定配体的诱导来控制相关蛋白的表达。该类应用在基因治疗等相关领域表现出一定的应用前景^[52]。

核开关作为一类保守的RNA元件，可以通过形成规整的三维结构和特定的识别口袋完成对配体的特异性识别，并通过结合配体前后的构象变化完成对下游基因表达的调控。相比于蛋白质参与的基因调控，核开关的调控方式具有更高的特异性和灵敏性。对核开关的研究不仅拓展了我们对RNA分子的结构与功能的认知，还帮助我们进一步理解了蛋白质出现以前的RNA世界的生命运作模式^[62]。核开关与配体小分子的作用模式也为我们进一步探讨“小分子靶向RNA”这一药学前沿热点提供了更多的参考。核开关自被发现以来，其自身的结构特点与功能特性使其在药物开发、基因治疗以及生物成像等方面均具有较大的应用潜力，目前已经有多项研究研发出以核开关为靶标的潜在抗生素药物，或者基于核开关开发出生物传感器或生物成像的新方法^[52-53]。

尽管目前已经鉴定出近60种核开关，但自然界中仍有大量未知的新型核开关有待鉴定。如前所述，配体种类未知，但具有核开关序列特征的RNA结构域被称为“孤儿核开关”。由于种种原因，大量“孤儿核开关”的配体鉴定仍然困难重重，需要我们进一步探索配体鉴定的新方法、新技术^[63]。随着生物学测序信息的进一步完善、RNA分子结构信息的积累以及人工智能的发展，相信新型核开关的鉴定也必将迎来更多的突破。未来对核开关深入而系统的研究将为我们揭示更多RNA识别不同配体的方式，进一步丰富和完善核开关调控基因表达的网络及作用方式。这些研究不但能帮助我们更好地理解生物调控系统的复杂性，还将为核开关在医学、生物工程等领域的应用提供更广阔的空间和可能性。

参考文献

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本文刊载于《自然杂志》2024年第2期

DOI：10.3969/j.issn.0253-9608.2024.02.004

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