摘要：腮腺炎病毒（MuV）是一种高度传染性的副粘病毒，在全球大多数地区流行，并继续在高度免疫的人群中引起爆发。即使在麻疹、腮腺炎和风疹疫苗接种率高的国家，腮腺炎的爆发也归因于免疫力下降和Jeryl Lynn疫苗株（A型）与流行野生型病毒之间的抗原差异。为了获得亚单位疫苗，我们使用基于结构的设计方法，工程化腮腺炎融合（F）糖蛋白，使其在预融合构象（Pre-F）中稳定，以及由Pre-F与腮腺炎血凝素神经氨酸酶（HN）组成的嵌合免疫原；在小鼠中，Pre-F抗原和嵌合抗原均能引发对A型、G型和H型腮腺炎的强大交叉反应性斑块减少中和滴度。腮腺炎Pre-F的晶体结构在2.16 Å分辨率下验证了稳定策略，同时工程化了F的后融合形式作为对照。从小鼠中分离出针对腮腺炎Pre-F和HN的单克隆抗体；14个Pre-F特异性抗体中有7个，15个HN特异性抗体中有9个能够中和G型MuV，效力范围不同。此外，14个Pre-F特异性抗体中有7个能够中和A型腮腺炎。对Pre-F特异性抗体的结构和结合分析揭示了它们与四个不同的中和抗原位点的结合，而对HN特异性抗体的结合分析揭示了它们与五个不同的中和抗原位点的结合。总体而言，Pre-F和嵌合Pre-F/HN免疫原是有前景的候选物，可以增强MMR诱导的腮腺炎免疫力，或作为下一代疫苗。
结果
设计一种含有二硫键和膜近端卷曲螺旋稳定的糖蛋白，以提高可溶性前融合腮腺炎F三聚体的产量。由副黏病毒前F糖蛋白引发的中和效价比后F对应物更有效；因此，我们旨在开发一种前融合稳定的腮腺炎F糖蛋白三聚体。我们从NS-EM观察到，仅在C末端卷曲螺旋上具有GCN4三聚化基序的纯化天然腮腺炎F糖蛋白主要呈现后融合构象。我们利用前融合型副流感病毒5型（PIV5）F糖蛋白的晶体结构（PDB ID 4GIP, 4WSG）构建了一个腮腺炎F蛋白的同源模型，由三个交织的单体形成DI、DII、DIII和HRB结构域的四级组装。通过创建一个二硫键替换和C末端卷曲螺旋-GCN4连接位置的矩阵，同时将切割位点残基101-103突变为三个甘氨酸残基（Gly3），我们评估了蛋白表达水平和采用前融合或后融合构象的蛋白比例，使用NS-EM（SI附录，图S1 A和B）。虽然五种二硫键、切割位点突变和GCN4连接位置的组合产生了100%前融合三聚体，但只有一种组合导致了高产蛋白表达（V206C-A223C与476-GCN4和101KRF-101GGG）在Expi293细胞中约为4.8 mg/L（SI附录，图S1A）。这种设计的NS-EM 2D平均值（SI附录，图S1 B，顶部插图）与未稳定的476-GCN4腮腺炎后F糖蛋白三聚体（SI附录，图S1 B，底部插图）形成对比，与之前对副黏病毒F蛋白构象的观察一致。我们专注于表达量最高的前F设计，并进行了进一步的表征和免疫研究，以评估其作为疫苗候选物的潜力。
腮腺炎前F糖蛋白三聚体的晶体结构在2.16 Å分辨率下揭示了稳定的二硫键设计和多态性残基的位置。通过尺寸排除色谱法对腮腺炎前F进行分析，显示出单一峰值（SI附录，图S1C），在存在kifunensine和每个原聚体6个潜在N-糖基化位点（PNGS）被酶解糖基化（Pre-F-Δglycan，SI附录，图S1C）时，可以结晶。X射线结构在2.16 Å分辨率下（图1 A和B和SI附录，表S1和图S1 D-F）揭示了与PIV5和其他副黏病毒前F三聚体相似的整体架构。然而，腮腺炎前融合F三聚体的顶端采用了一个“封闭帽”结构，由N177-S184环组成，通过T178、Q179和N181之间的侧链相互作用形成，这在其他副黏病毒前F结构中未观察到（SI附录，图S1E）。六个糖基化位点N73、N182、N352、N427、N433和N457的剩余N-乙酰葡萄糖胺部分在电子密度图中可见，并构建了Man5糖基化模型（SI附录，图S1F）。V206C-A223C二硫键在电子密度中清晰定义，Cα-Cα原子距离为4.8 Å，而在同源后融合PIV3 F三聚体结构[PDB ID 1ZTM]中，Cα-Cα原子相隔5.8 Å。DI-DIII结构域包围了一个大的含水腔室，体积约为17,000 ų，原聚体埋藏了6,500 Ų的界面，与在PIV5、PIV3、尼帕、麻疹和朗亚前F结构中观察到的相似。
尽管腮腺炎F和HN在基因型之间的序列相似性相对较高（图1E和SI附录，图S1 G和H），我们将多态性变异映射到腮腺炎前F和HN的结构上（图1 F和G和SI附录，图S1 H和I）。将变异映射到所有基因型的前F上，特别是基因型G和Jeryl Lynn（基因型A）之间，大部分暴露于抗体识别的蛋白质表面是保守的（图1 F和G），而许多可变氨基酸位于前融合三聚体核心的含水腔室中。相比之下，腮腺炎HN二聚体结构揭示大多数多态性氨基酸暴露于溶剂中，包括Jeryl Lynn和基因型G HNs在N464位置的糖基变异（SI附录，图S1 H和I）。HN上溶剂暴露的多态性残基的主导地位与前F相比可能表明，接种Jeryl Lynn疫苗的人对基因型G腮腺炎感染的抵抗力可能更多地受到HN变异的影响。
腮腺炎前F和前F/HN嵌合抗原在小鼠中引发高滴度中和抗体。我们评估了腮腺炎前F引发中和抗体的能力，与其他腮腺炎免疫原相比。CB6F1小鼠（每组10只）在0、3和10周接种polyI:C佐剂的腮腺炎糖蛋白（图2A）。除了腮腺炎前F和后F，我们还测试了单体HN和由腮腺炎前F与基因型G HN可溶性头部连接的嵌合免疫原（前F/HN）（SI附录，表S2），这种设计在我们之前与尼帕疫苗候选物的工作中显示引发了针对两种表面糖蛋白的抗体。这种前F/HN设计从Expi293细胞中产量约为0.3 mg/L，在尺寸排除色谱法上单分散，显示出预期的组装从NS-EM（图2B和SI附录，图S1C）。尽管图2B显示了前F/HN设计的代表性二维类平均值，但在EM下观察到HN头部与前F部分相对于GCN4基序的多种不同排列，这是由于在GCN4基序和HN头部之间使用的柔性连接。
图 2. 后融合F、前融合F和Pre-F/HN麻疹疫苗设计的免疫原性。(A) 在CB6F1/J小鼠中进行三次免疫接种，每次剂量为10微克，使用Poly I:C佐剂，在0、3和10周进行，分别在2、5、12和16周采血，使用BLI和空斑减少中和(PRNT)试验进行评估。(B) 麻疹Pre-F/HN设计的负染色表征，显示Pre-F三聚体、GCN4三聚体化域和三个HN球形头域的结构。使用(C)麻疹前融合F探针或(D)HN球形头域探针对免疫小鼠进行Octet生物干扰仪结合滴定。(E) 对于后融合F免疫原（左侧，开放圆圈）、前融合F免疫原（中间，实心圆圈）和前融合F/HN免疫原（右侧，上半部分填充圆圈）的小鼠，在0、3和10周进行三次免疫接种后的麻疹PRNT滴度（箭头显示），以及基因型G病毒（橙色）、Jeryl Lynn基因型A病毒（绿色）和基因型H病毒（蓝色）的PRN滴度。
使用生物层干涉测量（BLI），在接种含腮腺炎前F免疫原的小鼠血清中检测到对前F的抗体反应（前F或前F/HN），与接种后F免疫的小鼠血清相比，结合水平略低，尽管与接种前F免疫的小鼠血清相比没有统计学差异（图2C）。重组HN单体只与HN免疫小鼠血清结合，然而，单体HN免疫小鼠显示很少的结合（同样在三剂后基因型G几何平均PRNT ID60值为1:119），而接种前F/HN免疫的小鼠血清显示大量的HN结合，表明HN的多价性驱动了强大的体液反应（图2D）。
为了评估中和抗体的引发，我们测量了接种腮腺炎后F、前F和前F/HN的小鼠的基因型G PRNT（图2E）。每次免疫后都观察到中和活性的增加，然而，第三次免疫与第二次相比，中和效价的增加很小（图2E）。在接种后F免疫后观察到中和抗体，然而，前F引发的中和比后F高出3.5倍和2.5倍，分别在第二次（几何平均抑制剂量(ID60值)分别为141和499）和第三次免疫（几何平均ID60值）分别为322和789，分别针对基因型G腮腺炎病毒（MuV）。在第三次免疫后，前F/HN嵌合蛋白引发的中和效价比后F高出12倍，比前F高出5倍，几何平均ID60值为3,926针对基因型G病毒（图2E）。前F/HN嵌合体引发的中和活性高于单独的前F（比较两剂后前F和前F/HN，在未配对t检验中，P值<0.0001；图2E）。
我们进一步评估了针对基因型A（Jeryl Lynn）和基因型H病毒的PRNT，以表征工程免疫原引发的交叉中和抗体。对于后F和前F，我们观察到对Jeryl Lynn病毒引发的中和水平高于对基因型G病毒，而对于前F/HN嵌合体，则观察到等效的PRNT。在第16周，前F和前F/HN组的血清显示出对基因型H病毒的强大PRNT，证实这些重组免疫原可以引发能够交叉中和腮腺炎三种不同基因型的抗体（图2E）。我们评估了在第三剂后6个月内对基因型A、G和H MuVs的中和活性的持久性，并发现虽然效价自然下降，但ID60在三个月后稳定。接种前F的小鼠在6个月后对基因型G、Jeryl Lynn和基因型H病毒的几何平均PRNT分别约为100、800和3200（SI附录，图S2A）。相比之下，接种前F/HN的小鼠血清的ID60 PRNT在第三剂后6个月对基因型G、Jeryl Lynn和基因型H病毒分别稳定在大约750、900和4300（SI附录，图S2B）。总体而言，腮腺炎前F/HN产生的中和效价高于单独的F，证明嵌合设计策略能够引发对腮腺炎两种表面抗原的反应，并从单一多肽免疫原引发强大的中和活性。
疫苗引发的单克隆抗体分析揭示了多样的前F和HN反应。在图2A中描述的初次免疫系列（第0、3、10周）之后，CB6F1/J小鼠在第18周用腮腺炎前F或腮腺炎前F/HN进行加强免疫。初次免疫系列和加强免疫之间的时间允许抗体反应的成熟和亲和力增加。我们生成了生物素化的前F和单体HN探针，用于单B细胞排序和测序。使用已建立的抗体小组筛选分离的脾细胞，以识别特定于包括的腮腺炎前融合F偶联探针或腮腺炎HN偶联探针的B细胞，通过荧光激活细胞排序（FACS）单细胞指数排序到96孔板中（SI附录，图S3 A-F）。对排序的B细胞的B细胞受体进行测序，以获得配对的重链和轻链序列（SI附录，表S3）。从接种前F和前F/HN的小鼠中分别获得了63个前F特异性和47个HN特异性配对的重链和轻链序列（图3 A和C）。鉴定、表达并测试了32个独特的前F特异性克隆型和21个独特的HN特异性克隆型，以进行抗原结合。选择了14种基因多样的F和15种HN单克隆抗体（SI附录，表S4和S5）进行生产，并测试了对基因型G腮腺炎的中和活性（图3 D和E）。在29种测试效力的mAbs中，有9/14 F和9/15 HN导向的mAbs的IC50值范围从0.05 µg/mL到160 µg/mL，针对基因型G或基因型A，其中两种HN特异性抗体显示出最高的效力约为0.05 μg/mL（图3 D和E）。
竞争BLI被用来将前F特异性抗体分成针对腮腺炎前F上不同重叠或不重叠表位的组（图4A）。根据竞争模式，发现四组前F抗体彼此竞争，而一种抗体没有显示出明确的竞争模式。NS-EM分析Fab-前F复合物揭示了多样的抗体-抗原结合模式（图4B），从顶端结合物（B2和C2）到更角的结合物（B4、E6、C4、H4、F1、E2）和两个侧向结合物（H5和F3）。NS-EM结果证实了竞争结合数据，例如，抗体B2和C2在前F结构的顶端结合相似，它们竞争；而抗体F3和H5显示出类似的结合模式，并具有可比的竞争概况（图4 A和B）。这种EM分析和竞争数据之间的对应关系适用于所有鉴定的抗体，包括B6，它结合在茎的下部，不与其他抗体竞争。值得注意的是，所有14种前F抗体被选为详细表征，除了茎结合抗体B6外，都结合在前F三聚体的膜远端表位，预计这些表位将经历构象变化以转变为后F（图1 A-D）。针对膜远端表位的强效中和抗体也类似地观察到其他病毒融合糖蛋白，如RSV F（31）和PIV3 F。抗体竞争和结构及中和分析允许定义四个不同的腮腺炎中和F特异性表位（腮腺炎F抗原位点1至4）在腮腺炎前F的膜远端区域（图4 A和B）。
基于竞争结合模式，鉴定了五个不同的HN特异性中和抗体位点（图4C）。与前F特异性中和抗体不同，HN中和抗体的结合位点重叠有限。有趣的是，四种非中和抗体（D9、A12、G11、H11）聚集并相互竞争，暗示腮腺炎HN上有一个免疫优势的非中和表位，这可能在未来的工程努力中被掩盖，以集中免疫反应到中和表位。
我们使用BLI评估了14种前F抗体对18种不同基因型的腮腺炎前F蛋白的交叉反应性结合，这些蛋白使用V206C-A223C和101KRF-101GGG突变以及476-GCN4的添加稳定在其前融合构象中（图5A）。我们观察到9种前F特异性抗体对所有测试的前F基因型都有交叉反应性（与前F的结合阈值>1.45）。一些抗体对特定菌株的结合减少或消失，例如，抗体G2不结合Albany基因型A菌株F，这可以通过建模映射到单个残基变化，T91（其他测试菌株中的丙氨酸）并在残基N89引入N-糖基化位点（图5 B和C）。这可能取消了G2的结合，鉴于其独特的抗体竞争概况，G2表位可以映射到包含残基89-91的区域。
抗体B4显示出对Virginia基因型H菌株前F的结合丧失，与其它测试菌株相比，该菌株有多个独特的氨基酸变化（图5 D和E）。比较EM分析中B4 Fab相对于前F三聚体的结合位置，S70、A239和A243这些残基群可能在抗体结合足迹内（图4B）。然而，与B4竞争抗原位点2的抗体E6和H3不受Virginia基因型H菌株前F的变化影响，表明这些抗体对位点的结合有微妙的差异。
人类接种麻疹、腮腺炎和风疹（MMR）疫苗后，Jeryl Lynn株腮腺炎的几何平均滴度（GMT）免疫中和试验（PRNT）约为220，基因型G腮腺炎为35。通过免疫重组融合前稳定化的腮腺炎F糖蛋白免疫原在小鼠中诱导的交叉反应性高PRNT表明，Pre-F比Post-F更有效地诱导中和滴度，这一点在呼吸道合胞病毒（RSV）、尼帕病毒（Nipah）和副流感病毒（PIV）1-4中已有先前的证明。我们证明了Pre-F/HN嵌合体比单独的Pre-F诱导更高的中和活性，这与尼帕病毒的类似抗原设计一致。尽管Pre-F/HN抗原从平衡的Pre-F和HN特异性血清抗体滴度中诱导出，但激发出一组遗传多样性的F和HN单克隆抗体，其中Pre-F特异性抗体在不同的表位和接触角度与糖蛋白三聚体结合。竞争映射使得在融合前三聚体的膜远端部分定义了四个离散的中和抗原位点，在HN蛋白中定义了五个离散的中和抗原位点。值得注意的是，尽管3号和4号位点的中和单克隆抗体（C5和F3）分别结合Pre-F三聚体的膜远端区域，这些都是Pre-F特异性的，而1号位点的中和单克隆抗体（B2和C2）结合Pre-F的顶端，但对Post-F也是双特异性的。腮腺炎融合前F三聚体的顶端采用封闭帽结构，接近明显的B2和C2单克隆抗体结合位点，因此，这些单克隆抗体的表位可能包括或依赖于顶端的原聚体间相互作用。需要进一步的工作来理解抗原位点特异性、结构以及糖基化和基因型变异对中和的影响，类似于对RSV的Pre-F蛋白所做的工作。
腮腺炎Post-F诱导相对较高的中和滴度，这是一些副黏病毒（如PIV-2和PIV-4）观察到的现象，但不是PIV-3、PIV-1或尼帕病毒Post-F；因此，可能腮腺炎Pre-F和Post-F上都保留了中和敏感表位。腮腺炎融合前特异性中和单克隆抗体的NS-EM，这些抗体结合Pre-F的膜远端区域，表明相当一部分中和表位存在于腮腺炎F糖蛋白融合过程中发生构象变化的结构域中。
比较接种Pre-F小鼠与接种Pre-F/HN小鼠的反应，HN组分诱导更好的中和活性（Pre-F与Pre-F HN PRNT分别为499和2,604，P值<0.0001，未配对t检验）。包含Pre-F组分与HN扩大了免疫反应，并呈现了更多的抗原位点多样性。值得注意的是，尽管大多数Pre-F抗原位点具有中和和非中和定向的单克隆抗体，HN抗原位点的抗体倾向于根据抗原位点是中和或非中和的。我们的发现与先前对另一种副黏病毒尼帕病毒的工作大致一致。尼帕病毒Pre-F/G嵌合体在mRNA和蛋白质平台上与单独的G相比，展示了优越的尼帕病毒特异性Tfh和其他效应T细胞的诱导能力，并增加了T细胞反应的广度和频率。当与两个糖蛋白的中和抗体活性结合时，嵌合体与每个单独的抗原相比具有优势。虽然我们没有评估我们的MuV设计中的抗原特异性T细胞反应，我们不能排除Pre-F在增强对HN组分的T细胞反应和扩大整体中和抗体反应中可能的作用。T细胞的作用将在未来的研究报告中评估。
由于在接种两次MMR疫苗的个体中发生了腮腺炎暴发，因此需要对当前的腮腺炎疫苗进行创新，以减少疾病发病率和减轻公共卫生资源的负担。免疫实践咨询委员会（ACIP）建议在腮腺炎暴发环境中有感染腮腺炎风险的个体接种第三剂腮腺炎疫苗，与接种两剂MMR的个体相比，接种第三剂MMR的个体感染腮腺炎的风险降低了78%。然而，第三剂的反应可能受到先前免疫的抑制，中和滴度的增加非常有限且短暂。本文描述的亚单位蛋白疫苗候选物可能提供了一种在腮腺炎暴发环境中替代MMR接种的疫苗方式。
为了保护免受多种病毒血清型的侵害，已经需要多价疫苗，例如，黄病毒疫苗（登革热病毒血清型1至4）、流感疫苗和HPV疫苗。包含腮腺炎病毒粒子上两个关键中和抗体靶标的Pre-F/HN嵌合体能够激发对腮腺炎基因型A、G和H的强大交叉基因型中和反应，因此可能是大多数或所有流通的全球腮腺炎毒株的疫苗候选物。将基于结构的方法与遗传传递和佐剂技术的进步结合起来，可能提供一种有效的腮腺炎疫苗，可以提高接受者的免疫滴度并保护免受反复腮腺炎暴发的侵害。这些免疫原产生的抗体反应是否能够提供对疾病的保护，仍然是一个重要的问题，因为腮腺炎感染的保护相关因素仍然不清楚，T细胞免疫的作用也不清楚，尽管中和抗体滴度似乎与保护相关。需要进一步的临床前和临床测试来确定这里描述的疫苗候选物对腮腺炎消除工作的贡献潜力，无论是作为增强剂还是下一代人类腮腺炎疫苗的主要类别。
材料和方法
基于PIV5 F融合前结构（4GIP和4WSG）和PIV3 F融合后（1ZTM）结构设计了预融合稳定腮腺炎F突变体，并通过负染色电子显微镜（EM）评估了设计。使用带有His6-strepTagII标签的Expi293细胞表达蛋白，并通过尺寸排除色谱纯化蛋白。CB6F1/J小鼠被免疫以评估腮腺炎糖蛋白免疫原佐剂Poly I:C诱导中和抗体的能力。如前所述，通过FACS排序和重链与轻链的退化引物扩增分离小鼠抗体。进行了腮腺炎基因型A、G和H的PRNT测定，以确定血清和单克隆抗体的效力。更详细的信息在SI附录，材料和方法中提供。
数据、材料和软件可用性。腮腺炎Pre-F蛋白的原子坐标已存入蛋白质数据库（PDB），登录号为9DRQ。所有其他研究数据包含在文章和/或SI附录中。
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